Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å differensiere hiPSCer i øyefeltklynger og generere nevroretinale organoider ved bruk av forenklede kulturbetingelser som involverer både adherente og suspensjonskultursystemer. Andre okulære celletyper, som RPE og hornhinneepitelet, kan også isoleres fra modne øyefelt i retinale kulturer.
Pluripotente stamceller kan generere komplekse vevsorganoider som er nyttige for in vitro sykdomsmodelleringsstudier og for å utvikle regenerative terapier. Denne protokollen beskriver en enklere, robust og trinnvis metode for å generere retinale organoider i et hybridkultursystem bestående av adherente monolagskulturer i løpet av de første 4 ukene av retinal differensiering til fremveksten av distinkte, selvorganiserte øyefelt primordiale klynger (EFP). Videre blir de smultringformede, sirkulære og gjennomsiktige nevroretinale øyene i hver EFP manuelt plukket og dyrket under suspensjon ved bruk av ikke-adherente kulturretter i et retinalt differensieringsmedium i 1-2 uker for å generere flerlags 3D-optiske kopper (OC-1M). Disse umodne retinale organoider inneholder PAX6 + og ChX10 + prolifererende, multipotente retinale forløpere. Forløpercellene er lineært selvmonterte i organoidene og fremstår som distinkte radiale striper. Ved 4 uker etter suspensjonskultur gjennomgår retinalprogenitorene postmitotisk arrest og avstamningsdifferensiering for å danne modne retinale organoider (OC-2M). Fotoreseptoravstamningen forløpere utvikles innenfor de ytterste lagene av retinale organoider. Disse CRX + og RCVRN + fotoreceptorcellene morfologisk modnes for å vise indre segmentlignende utvidelser. Denne metoden kan brukes til å generere retinale organoider ved bruk av humane embryonale stamceller (hESCs) og induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Alle trinn og prosedyrer er tydelig forklart og demonstrert for å sikre reproduserbarhet og for bredere anvendelser i grunnleggende vitenskap og translasjonsforskning.
Netthinnen er et lysfølsomt vev som er tilstede på baksiden av vertebratøyet som omdanner lyssignaler til nerveimpulser ved et biokjemisk fenomen kjent som fototransduksjonsveien. De første nerveimpulser generert i fotoreceptorcellene i netthinnen blir transducert til andre retinale interneuroner og retinal ganglionceller (RGC) og når hjernens visuelle cortex, noe som hjelper til med bildeoppfattelse og visuell respons.
Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) er anslagsvis 1,5 millioner barn blinde, hvorav 1 million er i Asia. Arvelig retinal dystrofi (IRD) er en stor blindende sykdom som rammer 1 av 4000 individer over hele verden 1,2,3, mens forekomsten av blindhet forbundet med aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) varierer fra 0,6% –1,1% i utviklingsland 4. IRD er forårsaket av arvelige genetiske defekter i over 300 forskjellige gener involvert i retinal utvikling og funksjon5. Slike genetiske endringer resulterer i forstyrrelse av normale retinale funksjoner og gradvis degenerasjon av retinale celler, nemlig fotoreceptorcellene og retinalpigmentert epitel (RPE), og fører dermed til alvorlig synstap og blindhet. Enorme fremskritt har blitt gjort i andre blendende forhold som involverer hornhinnen, linsen, etc. Imidlertid har retinal dystrofier og optiske nerveatrofier ingen bevist terapi til dags dato. Siden en voksen menneskelig retina ikke har stamceller6, kan alternative kilder som embryonale stamceller (ESC) og pasientavledede induserte pluripotente stamceller (iPSCs) gi en ubegrenset tilførsel av ønskede celletyper og holde et stort løfte om å utvikle komplekse vevsorganoider som kreves for in vitro sykdomsmodelleringsstudier og for å utvikle regenerative terapier7, 8,9,10.
Flere år med retinal forskning har ført til en bedre forståelse av molekylære hendelser som orkestrerer tidlig retinal utvikling. De fleste protokoller for å generere retinale celler og 3D-organoider fra PSC-er tar sikte på å rekapitulere disse utviklingshendelsene in vitro ved å dyrke cellene i en kompleks cocktail av vekstfaktorer og små molekyler for å modulere de kjente biologiske prosessene på en trinnvis måte. De retinale organoider som dermed genereres, består av store retinale celler: retinale ganglionceller (RGC), interneuroner, fotoreceptorer og retinalpigmentert epitel (RPE) 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Til tross for vellykkede forsøk på modellering av IRD ved hjelp av retinale organoider, utgjør kravet til den komplekse cocktailen av vekstfaktorer og små molekyler under differensiering og den relativt lave effektiviteten av retinal organoidgenerering en stor utfordring med de fleste protokoller. De inkluderer hovedsakelig dannelsen av embryoidlegemer, etterfulgt av deres trinnvise differensiering i retinale linjer ved bruk av komplekse kulturforhold på forskjellige stadier av in vitro-utvikling 20,21,22.
Her rapporteres en forenklet og robust metode for å utvikle komplekse 3D neuro-retinale organoider fra sunn kontroll og retinal sykdomsspesifikke hiPSCs. Protokollen beskrevet her benytter direkte differensiering av nærkonfluente hiPSC-kulturer uten behov for embryoid kroppsdannelse. Også kompleksiteten til kulturmediet er forenklet, noe som gjør det til en kostnadseffektiv og reproduserbar teknikk som lett kan adopteres av nye forskere. Det innebærer et hybridkultursystem bestående av adherente monolagskulturer i løpet av de første 4 ukene av retinal differensiering til fremveksten av distinkte, selvorganiserte øyefelt primordiale klynger (EFP). Videre blir de sirkulære nevro-retinale øyene i hver EFP manuelt plukket og dyrket i suspensjonskulturer i 1-2 uker for å forberede flerlags 3D retinale kopper eller organoider bestående av PAX6 + og CHX10 + prolifererende nevro-retinale forløpere. Utvidet dyrkning av retinale organoider i 100 μM taurinholdig medium i ytterligere 4 uker resulterte i fremveksten av RCVRN + og CRX + fotoreceptorforløpere og modne celler med rudimentære indre segmentlignende utvidelser.
hiPSCs er et kraftig verktøy for å studere organ- og vevsutvikling in vitro. Rekapitulering av sykdomsfenotypen ved å differensiere sunne versus sykdomsspesifikke hiPSCs mot retinallinjen kan bidra til å få nyere innsikt i patofysiologien til forskjellige former for arvelige retinale dystrofier. Flere protokoller har blitt beskrevet og vedtatt for in vitro differensiering av PSC til retinale celletyper. De fleste av dem involverer bruk av kulturmedium som inneholder komplekse cocktailer av rekombin…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner den vitenskapelige og tekniske støtten fra Dr. Chitra Kannabiran, genetiker; Dr. Subhadra Jalali, retinal konsulent; Dr. Milind Naik, oculoplastisk kirurg; og Dr. Swathi Kaliki, okulær onkolog ved LV Prasad Eye Institute, Hyderabad mot generering av normale og pasientspesifikke iPSC-linjer. Forfatterne anerkjenner FoU-tilskuddene fra Science and Engineering Research Board, Department of Science and Technology (IM), (SB / SO / HS / 177/2013), Institutt for bioteknologi (IM), (BT / PR32404 / MED / 30 / 2136 / 2019) og seniorforskningsstipendier fra ICMR (S.M., D.P.), UGC (TA) og CSIR (VKP), Indias regjering.
0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |