الكشف عن بروتين البريون غير الطبيعي بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية

Summary

يتطلب وضع العلامات المناعية لبروتين البريون غير الطبيعي باستخدام بروتوكولات الكيمياء الهيستولوجية المناعية عينة محددة ومنهجيات تحضير الأجسام المضادة المضادة ل PrP. يصف هذا البروتوكول الخطوات الرئيسية في إزالة الخاتمة لضمان وضع العلامات المناعية المناسبة ل PrP وتقليل تلطيخ الخلفية غير المحدد. أيضا ، يأخذ هذا النهج في الاعتبار تدابير السلامة الحيوية عند إجراء دراسات الكيمياء الهيستولوجية المناعية مع الأنسجة المصابة بالبريون.

Abstract

بروتينات البريون غير الطبيعية (PrP^Sc) هي الشكل المتماثل المرتبط بالمرض لبروتين البريون الخلوي والعلامات التشخيصية لاعتلال الدماغ الإسفنجي القابل للانتقال (TSEs). تؤثر هذه الأمراض التنكسية العصبية على البشر والعديد من الأنواع الحيوانية وتشمل السكراب ، والاعتلال الدماغي الإسفنجي البقري الحيواني المنشأ (BSE) ، ومرض الهزال المزمن لعنق الرحم (CWD) ، ومرض بريون الإبل (CPD) الذي تم تحديده حديثا. يعتمد تشخيص TSEs على الكشف المناعي عن PrP^Sc عن طريق تطبيق كل من الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) وطرق اللطخة المناعية الغربية (WB) على أنسجة الدماغ ، أي جذع الدماغ (مستوى obex). IHC هي طريقة مستخدمة على نطاق واسع تستخدم الأجسام المضادة الأولية (وحيدة النسيلة أو متعددة النسيلة) ضد المستضدات ذات الأهمية في خلايا قسم الأنسجة. يمكن تصور ارتباط الجسم المضاد ومولد الضد من خلال تفاعل اللون الذي يظل موضعيا في منطقة النسيج أو الخلية حيث تم استهداف الجسم المضاد. على هذا النحو ، في أمراض البريون ، كما هو الحال في مجالات البحث الأخرى ، لا تستخدم تقنيات الكيمياء الهيستولوجية المناعية فقط لأغراض التشخيص ولكن أيضا في دراسات الإمراض. تتضمن هذه الدراسات الكشف عن أنماط وأنواع PrP^Sc من تلك الموصوفة سابقا لتحديد سلالات البريون الجديدة. نظرا لأن مرض جنون البقر يمكن أن يصيب البشر ، يوصى باستخدام مرافق و / أو ممارسات مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 3 (BSL-3) للتعامل مع الماشية والمجترات الصغيرة وعينات عنق الرحم المدرجة في مراقبة TSE. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام معدات الاحتواء والمعدات المخصصة للبريون ، كلما أمكن ذلك ، للحد من التلوث. يتكون إجراء PrP^Sc IHC من خطوة إزالة حامض الفورميك التي تعمل أيضا كإجراء لتعطيل البريون ، حيث تظل الأنسجة المثبتة بالفورمالين والأنسجة المضمنة بالبارافين المستخدمة في هذه التقنية معدية. عند تفسير النتائج ، يجب توخي الحذر للتمييز بين العلامات المناعية غير المحددة ووضع العلامات المستهدفة. لهذا الغرض ، من المهم التعرف على القطع الأثرية الخاصة بوضع العلامات المناعية التي تم الحصول عليها في التحكم السلبية المعروفة في TSE للتمييز بين تلك الأنواع المحددة من الملصقات المناعية PrP^Sc ، والتي يمكن أن تختلف بين سلالات TSE والأنواع المضيفة والنمط الجيني prnp ، الموصوف بمزيد من التفصيل هنا.

Introduction

وفقا لفرضية البريون ، فإن الشكل المتماثل غير الطبيعي (PrP^Sc) هو المكون الأساسي أو الوحيد للعامل المعدي في اعتلالات الدماغ الإسفنجية القابلة للانتقال (TSEs). يعتمد تأكيد تشخيص TSE على الكشف المناعي عن PrP^Sc عن طريق تطبيق بروتوكولات الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) و / أو طرق اللطخة المناعية الغربية (WB) لأنسجة الدماغ¹.

IHC هي طريقة تستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو ، في بعض الحالات ، الأجسام المضادة متعددة النسيلة (كأجسام مضادة أولية) كخطوة أولى في التلوين المناعي للمستضدات المستهدفة على وجه التحديد ذات الأهمية الموجودة في خلايا قسم الأنسجة. ثم يتم تصور أي ارتباط فعال بين الأجسام المضادة ومولد الضد الأولي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأجسام المضادة الأولية. يتم اقتران هذه الأجسام المضادة الثانوية بالإنزيمات ، مثل بيروكسيديز الفجل (HRP) أو الفوسفاتيز القلوي (AP). ثم يتم تحقيق التصور عن طريق إضافة ركيزة إلى هذه الإنزيمات ، مما ينتج عنه منتجات ملونة غير قابلة للذوبان موضعية في المناطق التي ترتبط فيها الأجسام المضادة الأولية بالمستضدات المستهدفة. يمكن تحقيق التصور المحسن عن طريق التلوين المضاد ، حيث يتم استخدام صبغة لخلق تباين بين الأنسجة المناعية وغير المناعية².

مع استخدام IHC للأنسجة المدمجة في البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE) ، يمكن أن يؤدي تثبيت الفورمالين إلى إبطال فعالية الأجسام المضادة الأولية بسبب الارتباط المتقاطع بواسطة الفورمالديهايد والتسخين والجفاف أثناء تضمين البارافين. هذه تغير شكل البروتينات ، وتدمير ، أو تغيير طبيعة ، أو إخفاء الحواتم ، وبالتالي تقليل أو إلغاء اكتشافها³. على هذا النحو ، يتطلب هذا استرجاع المستضد (AR). تعمل تقنيات AR على تعطيل الربط المتقاطع للمجموعة الكيميائية المرتبطة بالفورمالديهايد في جزيئات المستضد ، وبالتالي استعادة أو كشف التشكل الأصلي لبروتين المستضد. ينتج عن هذا استعادة تقارب الأجسام المضادة للمستضد (epitope) لوضع العلامات المناعية. تعتمد الفعالية النهائية للواقع المعزز على صفات المستضد المستهدف و / أو الجسم المضاد الأساسي².

استرجاع المستضد المستحث بالحرارة (HIER) هو أحد إجراءات AR³ ويستخدم بشكل روتيني للكشف عن PrP^Sc IHC ، كما هو موضح هنا. IHC ضروري للتشخيص ويستخدم في مختبرات الأبحاث لتحديد توزيع الأنسجة للمستضد المرتبط بالأمراض. يستخدم على نطاق واسع في تشخيص وبحث السرطان وعلم الأعصاب والأمراض المعدية⁴ ، من بين أمور أخرى. بالنسبة ل TSEs ، تلعب IHC دورا مهما في التشخيص والبحث لتأكيد والتحقيق في توزيع PrP^Sc في المضيفات الطبيعية والنماذج التجريبية. يساهم IHC في دراسات التسبب في البريون وتحليل أنواع وأنماط ترسب PrP^Sc ، وتحديدا في الأنسجة العصبية⁵ ، للكشف عن الانحرافات عن العدوى الموصوفة بشكل روتيني وتحديد سلالات البريون الجديدة المفترضة.

نظرا لأن بريونات الاعتلال الدماغي الإسفنجي البقري (BSE) يمكن أن تصيب البشر ، فقد تتطلب بعض البروتوكولات المختبرية المشاركة في العمل مع مرض جنون البقر استخدام مرافق وممارسات BSL-3⁶. ويشمل ذلك استخدام حاوية ثانوية محكمة الغلق لنقل عينات الأنسجة المصابة بمرض جنون البقر المحتملة داخل المعهد والمختبر. ويشمل أيضا تخصيص مناطق احتواء ومعدات مخصصة للبريون لأبحاث وتحليل مرض جنون البقر كلما أمكن ذلك. يتم ذلك لمنع التلوث خارج منطقة العمل وتوفير مساحة ضيقة حيث تصبح إجراءات إزالة التلوث ضرورية.

وبناء على ذلك، يتبع مختبر علم الأمراض التابع للمعهد الدولي لبحوث الأحياء مرافق وممارسات السلامة الأحيائية-3 (BSL-3) الموصى بها⁶ لإدارة عينات الأنسجة المحتملة المصابة بالبريون من الماشية والمجترات الصغيرة وعنق الرحم المرتبطة بمراقبة مرض التهاب الدماغ المؤقت.

يمكن أن تكون الأنسجة المثبتة بالفورمالين والأنسجة المضمنة في البارافين المدرجة في إجراءات التشخيص أو البحث في TSE ، خاصة في الجهاز العصبي المركزي ، معدية. وبالتالي ، يجب معالجة هذه الأنسجة الثابتة بحمض الفورميك لتقليل عدوى البريونات ، إن وجدت ، قبل معالجة الأنسجة. يتم تنفيذ ذلك عن طريق وضع أنسجة ثابتة ومشذبة (سمك 2-4 مم تقريبا) في شريط معالجة. ثم يتم غمر الكاسيت في 98٪ حمض الفورميك (لمدة 1 ساعة). بعد الغمر ، يتم غسل الكاسيتات بالأنسجة في ماء الصنبور الجاري لمدة 30 دقيقة ، وإعادتها إلى المثبت قبل المعالجة الإضافية. إذا لم تتم معالجة أقسام الأنسجة قبل المعالجة ، فيجب غمر أقسام الأنسجة بعد المجهرية في حمض الفورميك غير المخفف لمدة 5 دقائق على الأقل قبل تلطيخ الأنسجة⁷. يتضمن بروتوكول IHC ل PrP^Sc خطوة روتينية لإزالة حامض الفورميك ، تعمل أيضا على تعطيل البريونات⁷. بعد خطوات تعطيل البريون هذه ، يمكن بعد ذلك معالجة الأنسجة الثابتة الناتجة في BSL-2 باستخدام ممارسات BSL-2 القياسية.

الحد الأدنى من متطلبات أخذ عينات الأنسجة لتشخيص TSE في أي مدرج في مراقبة TSE هو جمع جذع الدماغ (على مستوى obex). بالإضافة إلى ذلك ، للكشف عن مرض جنون البقر غير النمطي والسكرابي ، ينصح أيضا بجمع جزء من المخيخ ^1,8. لتشخيص CWD ، يجب اختبار كل من جذع الدماغ (obex) والغدد الليمفاوية البلعومية حيث يمكن اكتشاف PrP Sc في الأنسجة اللمفاوية مع عدم وجود PrP^Sc يمكن اكتشافه في obex⁹ ، الذي استعرضه Machado et ^al.10.

يتضمن الجزء obex من جذع الدماغ مواقع مستهدفة TSE تشخيصية ، وهي النواة المبهمية الظهرية (DVN) ونواة القناة الانفرادية (STN) ونواة المسالك الشوكية للعصب الثلاثي التوائم (V). تقدم هذه المناطق باستمرار تراكم PrP^Sc الثنائي ، حتى في المراحل المبكرة من مرض جنون البقر والسكرابي الكلاسيكي. في الحالات السريرية ل TSE المتقدم ، تظهر جميع مناطق المادة الرمادية داخل جذع الدماغ توزيع PrP^Sc على نطاق واسع¹¹.

قبل التقسيم والمعالجة ، يتم تقييم عينات الدماغ (الشكل 1) للتأكد من مستوى التحلل الذاتي ووجود أي تلف في الأنسجة يحتمل أن يضر بملاءمة العينة للتشخيص التتأكيدي القائم على IHC⁸. للتحقق من سلامة البروتوكولات التحضيرية والنتائج التحليلية ، يتم تضمين عينات الأنسجة الإيجابية والسلبية TSE كضوابط بالتزامن مع تحضير الأنسجة من حالات الاختبار في كل فحص.

الشكل 1: إجراء PrP^Sc IHC. تمثيل يوضح التسلسل التدريجي لإجراء PrP^Sc IHC من إزالة البارافين من أقسام الأنسجة إلى التلوين المناعي والكشف في نهاية المطاف (FFPE – البارافين الثابت بالفورمالين ؛ ماب – الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. DAB – 3،3 ‘ديامينوبنزيدين ). تم إنشاء هذا الرقم في عام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

إن إجراء المدينة العالمية للخدمات الإنسانية الموصوف هنا هو أحد مكونات المشروع البحثي FAIRJ-CT98-7021 ، “إنشاء شبكة أوروبية لمراقبة TSE المجترات وتوحيد وتنسيق عملية ومعايير تحديد الحالات المشتبه فيها”. وهو يتبع معايير التشخيص التي حددتها المنظمة العالمية لصحة الحيوان ، WOAH (المسمى سابقا المكتب الد…

Representative Results

بالنظر إلى أن وضع العلامات المناعية المستهدفة غير المحددة ممكن ، فمن المهم التأكد من مستوى وضع العلامات المناعية غير المحددة في التحكم السلبية المعروفة في TSE. هذه خطوة مهمة لتفسير العلامات المناعية المحددة ل PrPSc 7 بشكل صحيح (الشكل 2). لوحظ أن العلامات…

Discussion

TSEs هي أمراض حيوانية المنشأ محتملة. بعد ظهور مرض جنون البقر في عام 1986 في المملكة المتحدة ، أصبحت البرتغال واحدة من الدول الأعضاء في الاتحاد الأوروبي مع ارتفاع معدل الإصابة بهذا المرض^14,15. من أجل السيطرة على هذا المرض ، تم تطوير آليات المراقبة الأخرى التي ظهرت (…

Materials

Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted