Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.
Abstract
Tümör biyolojisini anlamadaki kayda değer ilerlemelere rağmen, klinik çalışmalara giren onkoloji ilaç adaylarının büyük çoğunluğu, genellikle klinik etkinlik eksikliği nedeniyle başarısız olmaktadır. Bu yüksek başarısızlık oranı, mevcut preklinik modellerin, esas olarak tümör heterojenliğini ve tümör mikroçevresini yansıtmadaki yetersizlikleri nedeniyle klinik etkinliği tahmin edememelerini aydınlatmaktadır. Bu sınırlamalar, bireysel hastalardan elde edilen insan tümör örneklerinden oluşturulan 3 boyutlu (3D) kültür modelleri (sferoidler) ile ele alınabilir. Bu 3D kültürler, gerçek dünya biyolojisini, tümör heterojenliğini yansıtmayan yerleşik hücre çizgilerinden daha iyi temsil eder. Ayrıca, 3B kültürler 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar) daha iyidir, çünkü hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltırlar ve doğal hücre şeklini ve büyümesini korurlar. Bu çalışmada, 3D olan ve çok hücreli sferoidlerde büyüyen bireysel hastalardan kanser hücrelerinin primer kültürlerinin hazırlanması için bir yöntem geliştirilmiştir. Hücreler doğrudan hasta tümörlerinden veya hasta kaynaklı ksenogreftlerden türetilebilir. Yöntem, katı tümörlere (örneğin, kolon, meme ve akciğer) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda özel ekipmanlara güvenmeden tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Burada, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) oluşturmak ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmek için bir protokol sunulmuştur: bir hücre canlılık testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Bu çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
İn vitro ve in vivo çalışmalar, kanser tedavilerinin geliştirilmesinde tamamlayıcı yaklaşımları temsil etmektedir. İn vitro modeller çoğu deneysel değişkenin kontrolüne izin verir ve nicel analizleri kolaylaştırır. Genellikle düşük maliyetli tarama platformları olarak hizmet ederler ve mekanik çalışmalar için de kullanılabilirler1. Bununla birlikte, biyolojik alaka düzeyleri doğal olarak sınırlıdır, çünkü bu tür modeller tümör mikroçevresini sadece kısmen yansıtır1. Buna karşılık, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) gibi in vivo modeller, tümör mikroçevresinin karmaşıklığını yakalar ve translasyonel çalışmalar ve hastalarda bireyselleştirici tedavi için daha uygundur (yani, bireysel bir hastadan türetilen bir modelde ilaçlara verilen yanıtı araştırmak)1. Bununla birlikte, in vivo modeller, deneysel parametreler in vitro modeller kadar sıkı bir şekilde kontrol edilemediğinden ve gelişimleri zaman alıcı, emek yoğun ve maliyetli olduğundan ilaç taraması için yüksek verimli yaklaşımlara elverişli değildir 1,2.
İn vitro modeller 100 yılı aşkın bir süredir mevcuttur ve hücre hatları 70 yılı aşkın bir süredir mevcuttur3. Bununla birlikte, son birkaç on yılda, solid tümörlerin mevcut in vitro modellerinin karmaşıklığı çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu karmaşıklık, tümör kaynaklı yerleşik hücre hatları veya birincil hücre hatları olan 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar), 3 boyutlu (3B) modelleri içeren daha yeni yaklaşımlara kadar uzanır1. 2B modellerde, kurulan ve birincil hücre çizgileri4 arasında önemli bir ayrım vardır. Kurulan hücre hatları ölümsüzleştirilir; Bu nedenle, aynı hücre hattı, tarihsel bir perspektiften bakıldığında, işbirliğini, veri birikimini ve birçok tedavi stratejisinin geliştirilmesini kolaylaştıran uzun yıllar boyunca küresel olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarındaki genetik anormallikler her geçişte birikir ve böylece biyolojik alaka düzeylerini tehlikeye atar. Ayrıca, mevcut hücre hatlarının sınırlı sayısı, 4,5 hastalarında tümörlerin heterojenliğini yansıtmamaktadır. Primer kanser hücre hatları doğrudan biyopsiler, plevral efüzyonlar veya rezeksiyonlar yoluyla elde edilen rezeke tümör örneklerinden elde edilir. Bu nedenle, birincil kanser hücre hatları, tümör mikroçevresinin unsurlarını ve hücreler arası davranışlar (örneğin, sağlıklı ve kanserli hücreler arasındaki çapraz konuşma) ve kanser hücrelerinin kök benzeri fenotipleri gibi tümör özelliklerini korudukları için biyolojik olarak daha önemlidir. Bununla birlikte, birincil hücre hatlarının replikatif kapasitesi sınırlıdır, bu da dar bir kültür süresine yol açar ve analizler için kullanılabilecek tümör hücrelerinin sayısını sınırlar 4,5.
3D kültürleri kullanan modeller, in vivo koşullar korunduğundan 2D kültür modellerinden biyolojik olarak daha önemlidir. Böylece, 3D kültür modelleri doğal hücre şeklini ve büyümesini korur ve hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltır. Kanser araştırmalarında en yaygın kullanılan 3D modeller arasında çok hücreli sferoidler, iskele tabanlı yapılar ve matrise gömülü kültürlerbulunur 4,6,7.
Mevcut protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) üretmekte ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmektedir: hücre canlılığı testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Burada sunulan temsili sonuçlar meme ve kolon kanserinden; Bununla birlikte, bu protokol diğer katı tümör tiplerine (örneğin, kolanjiyokarsinom, gastrik, akciğer ve pankreas kanseri) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında özel ekipmana dayanmadan tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Bu yaklaşım kullanılarak üretilen çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.
Bu protokol üç bölüme ayrılmıştır: (1) ilaç etkinliğini test etmek için bir model olarak kullanılmalarına hazırlık olarak sferoidlerin oluşturulması, toplanması ve sayılması; (2) Sferoidler üzerindeki ilaç etkinliğini değerlendirmek için MTT testi; ve (3) ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde başka bir yaklaşım olarak sferoidlerin ilaçlarla tedavisini takiben morfolojik değişikliklerin mikroskobik olarak değerlendirilmesi (Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, insan tümör örneklerinden türetilen 3D birincil hücre kültürleri (sferoidler) üretmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Bu sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını ve ilaç kombinasyonlarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak da dahil olmak üzere çeşitli analizler için kullanılabilir. Protokol, doğrudan hasta örneklerinden türetilen primer tümör hücrelerini veya hasta örne…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiç kimse.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
