El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.
A pesar de los notables avances en la comprensión de la biología tumoral, la gran mayoría de los candidatos a fármacos oncológicos que ingresan a los ensayos clínicos fracasan, a menudo debido a la falta de eficacia clínica. Esta alta tasa de fracaso ilumina la incapacidad de los modelos preclínicos actuales para predecir la eficacia clínica, principalmente debido a su insuficiencia para reflejar la heterogeneidad tumoral y el microambiente tumoral. Estas limitaciones se pueden abordar con modelos de cultivo tridimensionales (3D) (esferoides) establecidos a partir de muestras de tumores humanos derivados de pacientes individuales. Estos cultivos 3D representan la biología del mundo real mejor que las líneas celulares establecidas que no reflejan la heterogeneidad tumoral. Además, los cultivos 3D son mejores que los modelos de cultivo bidimensionales (2D) (estructuras monocapa), ya que replican elementos del entorno tumoral, como hipoxia, necrosis y adhesión celular, y preservan la forma y el crecimiento natural de las células. En el presente estudio, se desarrolló un método para preparar cultivos primarios de células cancerosas de pacientes individuales que son 3D y crecen en esferoides multicelulares. Las células pueden derivarse directamente de tumores de pacientes o xenoinjertos derivados de pacientes. El método es ampliamente aplicable a tumores sólidos (por ejemplo, colon, mama y pulmón) y también es rentable, ya que se puede realizar en su totalidad en un laboratorio típico de investigación / biología celular del cáncer sin depender de equipos especializados. En este documento, se presenta un protocolo para generar modelos de cultivo tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primarias y evaluar su sensibilidad a los medicamentos utilizando dos enfoques complementarios: un ensayo de viabilidad celular (MTT) y exámenes microscópicos. Estos esferoides multicelulares se pueden utilizar para evaluar posibles candidatos a fármacos, identificar posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, e investigar los mecanismos de respuesta y resistencia.
Los estudios in vitro e in vivo representan enfoques complementarios para desarrollar tratamientos contra el cáncer. Los modelos in vitro permiten el control de la mayoría de las variables experimentales y facilitan los análisis cuantitativos. A menudo sirven como plataformas de detección de bajo costo y también se pueden utilizar para estudios mecanicistas1. Sin embargo, su relevancia biológica es inherentemente limitada, ya que tales modelos sólo reflejan parcialmente el microambiente tumoral1. Por el contrario, los modelos in vivo, como los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), capturan la complejidad del microambiente tumoral y son más adecuados para estudios traslacionales y tratamiento individualizado en pacientes (es decir, investigar la respuesta a fármacos en un modelo derivado de un paciente individual)1. Sin embargo, los modelos in vivo no son propicios para enfoques de alto rendimiento para el cribado de fármacos, ya que los parámetros experimentales no pueden controlarse tan estrechamente como en los modelos in vitro y porque su desarrollo requiere mucho tiempo, requiere mucha mano de obra y es costoso 1,2.
Los modelos in vitro han estado disponibles por más de 100 años, y las líneas celulares han estado disponibles por más de 70 años3. Durante las últimas décadas, sin embargo, la complejidad de los modelos in vitro disponibles de tumores sólidos ha aumentado dramáticamente. Esta complejidad abarca desde modelos de cultivo bidimensionales (2D) (estructuras monocapa) que son líneas celulares establecidas derivadas de tumores o líneas celulares primarias hasta los enfoques más recientes que involucran modelos tridimensionales (3D)1. Dentro de los modelos 2D, una distinción clave es entre las líneas celulares establecidas y primarias4. Las líneas celulares establecidas son inmortalizadas; Por lo tanto, la misma línea celular se puede utilizar globalmente durante muchos años, lo que desde una perspectiva histórica, facilita la colaboración, la acumulación de datos y el desarrollo de muchas estrategias de tratamiento. Sin embargo, las aberraciones genéticas en estas líneas celulares se acumulan con cada paso, comprometiendo así su relevancia biológica. Además, el número limitado de líneas celulares disponibles no refleja la heterogeneidad de los tumores en los pacientes 4,5. Las líneas celulares de cáncer primario se derivan directamente de muestras tumorales resecadas obtenidas mediante biopsias, derrames pleurales o resecciones. Por lo tanto, las líneas celulares de cáncer primario son biológicamente más relevantes ya que preservan elementos del microambiente tumoral y las características del tumor, como los comportamientos intercelulares (por ejemplo, la diafonía entre células sanas y cancerosas) y los fenotipos similares a los vástagos de las células cancerosas. Sin embargo, la capacidad replicativa de las líneas celulares primarias es limitada, lo que conduce a un tiempo de cultivo estrecho y limita el número de células tumorales que pueden ser utilizadas para los análisis 4,5.
Los modelos que utilizan cultivos 3D son biológicamente más relevantes que los modelos de cultivo 2D, ya que se conservan las condiciones in vivo. Por lo tanto, los modelos de cultivo 3D preservan la forma y el crecimiento natural de las células y replican elementos del entorno tumoral, como la hipoxia, la necrosis y la adhesión celular. Los modelos 3D más utilizados en la investigación del cáncer incluyen esferoides multicelulares, estructuras basadas en andamios y cultivos incrustados en matrices 4,6,7.
El presente protocolo genera modelos de cultivo tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primarias y evalúa su sensibilidad a los fármacos utilizando dos enfoques complementarios: un ensayo de viabilidad celular (MTT) y exámenes microscópicos. Los resultados representativos presentados en este documento son de cáncer de mama y colon; Sin embargo, este protocolo es ampliamente aplicable a otros tipos de tumores sólidos (por ejemplo, colangiocarcinoma, cáncer gástrico, de pulmón y de páncreas) y también es rentable, ya que se puede realizar en su totalidad en un laboratorio típico de investigación / biología celular del cáncer sin depender de equipos especializados. Los esferoides multicelulares generados utilizando este enfoque se pueden utilizar para evaluar posibles candidatos a fármacos, identificar posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos e investigar los mecanismos de respuesta y resistencia.
Este protocolo se divide en tres secciones: (1) la generación, recolección y conteo de los esferoides en preparación para su uso como modelo para probar la eficacia del fármaco; (2) ensayo MTT para evaluar la eficacia del fármaco en los esferoides; y (3) la evaluación microscópica de los cambios morfológicos después del tratamiento de los esferoides con fármacos como otro enfoque para evaluar la eficacia del fármaco (Figura 1).
El presente protocolo describe un método simple para generar cultivos celulares primarios 3D (esferoides) derivados de muestras de tumores humanos. Estos esferoides se pueden utilizar para diversos análisis, incluida la evaluación de posibles candidatos a fármacos y combinaciones de fármacos, la identificación de posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, y la investigación de los mecanismos de respuesta y resistencia. El protocolo utiliza células tumorales primarias derivadas directamente de muestras de p…
The authors have nothing to disclose.
Ninguno.
5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |