Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Summary

Le présent protocole décrit la génération de modèles de culture tumorale 3D à partir de cellules cancéreuses primaires et l’évaluation de leur sensibilité aux médicaments à l’aide de tests de viabilité cellulaire et d’examens microscopiques.

Abstract

Malgré des progrès remarquables dans la compréhension de la biologie tumorale, la grande majorité des candidats médicaments oncologiques entrant dans les essais cliniques échouent, souvent en raison d’un manque d’efficacité clinique. Ce taux d’échec élevé met en lumière l’incapacité des modèles précliniques actuels à prédire l’efficacité clinique, principalement en raison de leur incapacité à refléter l’hétérogénéité tumorale et le microenvironnement tumoral. Ces limitations peuvent être résolues avec des modèles de culture (sphéroïdes) en 3 dimensions (3D) établis à partir d’échantillons de tumeurs humaines provenant de patients individuels. Ces cultures 3D représentent mieux la biologie du monde réel que les lignées cellulaires établies qui ne reflètent pas l’hétérogénéité tumorale. De plus, les cultures 3D sont meilleures que les modèles de culture en 2 dimensions (2D) (structures monocouches) car elles reproduisent des éléments de l’environnement tumoral, tels que l’hypoxie, la nécrose et l’adhésion cellulaire, et préservent la forme et la croissance naturelles des cellules. Dans la présente étude, une méthode a été développée pour préparer des cultures primaires de cellules cancéreuses provenant de patients individuels qui sont 3D et se développent dans des sphéroïdes multicellulaires. Les cellules peuvent être dérivées directement de tumeurs de patients ou de xénogreffes dérivées de patients. La méthode est largement applicable aux tumeurs solides (par exemple, le côlon, le sein et le poumon) et est également rentable, car elle peut être réalisée dans son intégralité dans un laboratoire typique de recherche sur le cancer / biologie cellulaire sans compter sur un équipement spécialisé. Ici, un protocole est présenté pour générer des modèles de culture tumorale 3D (sphéroïdes multicellulaires) à partir de cellules cancéreuses primaires et évaluer leur sensibilité aux médicaments en utilisant deux approches complémentaires: un test de viabilité cellulaire (MTT) et des examens microscopiques. Ces sphéroïdes multicellulaires peuvent être utilisés pour évaluer des candidats médicaments potentiels, identifier des biomarqueurs potentiels ou des cibles thérapeutiques, et étudier les mécanismes de réponse et de résistance.

Introduction

Les études in vitro et in vivo représentent des approches complémentaires pour le développement de traitements contre le cancer. Les modèles in vitro permettent de contrôler la plupart des variables expérimentales et facilitent les analyses quantitatives. Ils servent souvent de plates-formes de criblage à faible coût et peuvent également être utilisés pour des études mécanistes¹. Cependant, leur pertinence biologique est intrinsèquement limitée, car de tels modèles ne reflètent que partiellement le microenvironnement tumoral¹. En revanche, les modèles in vivo, tels que les xénogreffes ....

Protocol

La collecte d’échantillons de tumeurs humaines utilisés pour les cultures de cellules tumorales primaires a été effectuée conformément aux protocoles approuvés par le comité d’examen institutionnel (IRB) au Centre médical Rabin avec le consentement éclairé écrit des patients. Les patients admissibles à participer à l’étude comprenaient des patients atteints d’un cancer du sein, du côlon, du foie, du poumon, neuroendocrinien, ovarique ou pancréatique non métastatique, de tout cancer pédiatrique ou de tout cancer métastatique. Le seul critère d’exclusion était l’incapacité de donner un consentement éclairé.

1. Génération et collection d....

Results

Ce protocole présente des procédures pour générer une culture homogène de sphéroïdes à partir de cellules tumorales primaires, évaluer quantitativement l’efficacité du médicament sur culture sphéroïde (test MTT) et déterminer l’effet des médicaments à l’étude sur la morphologie sphéroïde. Les données des expériences représentatives sur les sphéroïdes générés à partir de cultures de cellules cancéreuses du côlon et du sein sont présentées. Des expériences similaires ont été réalisées en utilisant d’autres types de tumeurs.......

Discussion

Le présent protocole décrit une méthode simple pour générer des cultures cellulaires primaires 3D (sphéroïdes) dérivées d’échantillons de tumeurs humaines. Ces sphéroïdes peuvent être utilisés pour diverses analyses, y compris l’évaluation de candidats médicaments potentiels et de combinaisons de médicaments, l’identification de biomarqueurs potentiels ou de cibles thérapeutiques, et l’étude des mécanismes de réponse et de résistance. Le protocole utilise soit des cellules tumorales primaires dérivées directement d’échan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Fluorouracile	TEVA Israël	lot 16c22NA	Fluorouracile, Adrucil
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutase Dissociation cellulaire
Cisplatine	TEVA Israël	20B06LA	Abiplatin,  ;
Cultrex  ;	Trevigen	3632-010-02	Matrice de membrane basale, type 3
DMSO (diméthylsulfoxyde)	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Sérum fœtal bovin (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2391595
Fluromètre  ; Lecteur ELISA	Biotek	Synergy H1	Gen5 3.11
Acide chlorhydrique (HCl)  ;	Sigma Aldrich	320331	pour la solution d’arrêt
ImageJ	National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis	. Version 1.52a	Logiciel open source ImageJ
Isopropanol	Gadot	P180008215	pour solution d’arrêt
L-glutamine	Gibco	1843977
MTT  ;	Sigma Aldrich	M5655-1G	3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromure
Acides aminés non essentiels  ;	Gibco	11140050
Palbociclib  ;   ;	Med Chem Express	CAS # 571190-30-2
PBS	Gibco	14190094	Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Sans pénicilline de calcium et de magnésium
&ndash ; streptomycine  ;	Invitrogen	2119399
Sans Phénol RPMI 1640	Industries biologiques, Israël	01-103-1A
Réservoir de pipetage	Alexred	RED LTT012025
RPMI-1640 milieu de culture  ;	Gibco	11530586
Sunitinib	Med Chem Express	CAS # 341031-54-7
Trastuzumab	F. Hoffmann - La Roche Ltd, Bâle, Switherland	10172154 IL	Herceptin
Trypan blue 0,5 % solution	Biological industries, Israël	03-102-1B
Fixation ultra-basse 96 plaque de puits	Greiner Bio-one	650970
Vinorelbine	Ebewe	11733027-03	Navelbine