Isolement, activation et expansion des lymphocytes T par flottation à partir d’échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique humain à l’aide de microbulles
Summary
L’objectif de cette étude est de démontrer la faisabilité de la séparation basée sur la flottation pour isoler, activer et développer les cellules T humaines primaires.
Abstract
Le processus d’isolement des lymphocytes T des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) pour établir des cultures ex vivo est crucial pour la recherche, les essais cliniques et les thérapies cellulaires. Dans cette étude, un protocole simple et novateur pour isoler, activer et étendre les cellules T des PBMC ex vivo est présenté. Cette étude utilise la technologie de tri cellulaire activé par flottabilité fonctionnalisée (BACS) pour isoler et activer les cellules T. En bref, le protocole implique la sélection positive de cellules CD3+ à partir de PBMC dérivés de leukopak, suivie d’une co-stimulation de 48 heures avec des microbulles de streptavidine (SAMB) pré-conjuguées anti-CD28 avant la transduction dans des plaques à 24 puits. Les microbulles fonctionnalisées offrent une occasion unique d’activer les cellules de manière dynamique, conduisant à des phénotypes prolifératifs qui permettent une expansion avec un minimum d’épuisement. Cette technique offre un épuisement réduit car les microbulles co-stimulatrices restent flottantes et retournent au sommet du milieu de culture, réduisant ainsi le temps pendant lequel les cellules en expansion sont en contact avec les facteurs co-stimulants. Les résultats indiquent que les lymphocytes T isolés et cultivés reçoivent suffisamment de stimulation pour s’activer et proliférer, mais pas au point de conduire à une suractivation, ce qui conduit ensuite à l’épuisement, comme le démontre la présence excessive de-1.
Introduction
Plus de 500 essais cliniques de thérapie cellulaire CAR-T à récepteur antigénique chimérique (CAR) sont actuellement menés dans le monde entier, et quatre produits de thérapie cellulaire CAR-T sont disponibles sur le marché1. Cependant, il existe encore de nombreux besoins en matière de recherche et de fabrication de cellules CAR-T qui doivent être satisfaits pour améliorer l’efficacité, l’évolutivité et le succès à long terme de ces thérapies potentiellement curatives 2,3,4,5. La recherche clinique et la fabrication de cellules CAR-T adoptives commencent par l’isolement des cellules T à partir d’un échantillon de sang périphérique et la stimulation, la transduction et l’expansion ultérieures des cellules isolées. Des paramètres tels que la récupération des lymphocytes T, la pureté et les signaux d’activation/épuisement doivent être soigneusement pris en compte lors du choix des techniques d’isolement et de stimulation des cellules pour la recherche et la fabrication de cellules CAR-T 3,4,6. Il est important de noter que l’amélioration de la persistance thérapeutique des thérapies cellulaires CAR-T en minimisant les obstacles biologiques résultant des procédés de fabrication actuels, tels que l’épuisement des lymphocytes T, est nécessaire pour améliorer l’efficacité thérapeutique 6,7.
Comme alternative aux méthodes traditionnelles d’isolement cellulaire telles que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), ici, le tri cellulaire activé par flottabilité (BACS) avec des microbulles pour l’isolement des lymphocytes T est démontré. La séparation des microbulles utilise des microsphères creuses flottantes (microbulles) pour lier les cibles et les faire flotter à la surface des échantillons de fluide 8,9. En fonctionnalisant les microbulles avec des anticorps (c.-à-d. anti-CD3), les populations de lymphocytes T souhaitées peuvent être sélectionnées positivement à partir d’échantillons de sang périphérique. Par la suite, l’utilisation d’une population différente de microbulles fonctionnalisées par anticorps (c.-à-d. anti-CD28) pour co-stimuler et activer positivement des cellules T sélectionnées positivement en suspension est démontrée dans ce travail. Les microbulles offrent un flux de travail d’isolation et d’activation simple et hautement réglable qui génère des cellules T prêtes pour la culture de cellules en suspension et les applications en aval telles que la modification génétique et l’expansion. De manière critique, l’activation cellulaire flottante avec des microbulles favorise la stimulation cellulaire restreinte pour prévenir l’épuisement excessif des lymphocytes T7.
Pour cette étude, la cytométrie en flux a été le principal outil utilisé pour analyser l’isolement, l’activation et le succès de la transduction des microbulles fonctionnalisées, ainsi que pour fournir des informations détaillées sur les sous-populations spécifiques présentes pendant les phases de croissance et d’expansion post-transduction. En plus de la cytométrie en flux, la microscopie à fond clair et la microscopie à fluorescence ont été utilisées pour confirmer la santé cellulaire, la morphologie et le succès de la transduction. Sur la base de ces résultats, la technologie et le protocole des microbulles offrent une alternative plus accordable et plus douce aux méthodes traditionnelles d’isolement et d’activation actuellement utilisées; en particulier, les cellules activées par microbulles montrent une expression nettement plus faible des marqueurs d’épuisement des lymphocytes T que celle généralement observée avec les outils et les kits standard de l’industrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit permet l’isolement des cellules T à partir d’échantillons de PBMC et l’activation des cellules T en suspension dans des milieux de culture avec des microbulles. Cette méthode repose sur des microbulles fonctionnalisées dont la flottabilité inhérente offre une occasion unique d’introduire des signaux co-stimulateurs aux cellules et de les activer lorsqu’elles sont suspendues dans un milieu de culture, réduisant ainsi l’exposition des cellules en expansion à une stimulation prolong?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).
