Cet article détaille les méthodes de diagnostic des cardiopathies congénitales (CHD) murines utilisant l’échocardiographie fœtale, la nécropsie et la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de la microscopie confocale épiscopique (ECM) suivie d’une reconstruction tridimensionnelle (3D).
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Article de méthode
Un pipeline pour caractériser les malformations cardiaques structurelles chez la souris fœtale
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cardiopathies congénitales (CHD) sont les principales causes de mortalité infantile aux États-Unis. Dans les années 1980 et plus tôt, la plupart des patients atteints de coronaropathie modérée ou sévère mouraient avant l’âge adulte, avec la mortalité maximale au cours de la première semaine de vie. Des progrès remarquables dans les techniques chirurgicales, les approches diagnostiques et la prise en charge médicale ont conduit à des améliorations marquées des résultats. Pour répondre aux besoins de recherche critiques de la compréhension des malformations cardiaques congénitales, les modèles murins ont fourni une plate-forme de recherche idéale, car ils ont une anatomie cardiaque très similaire à celle des humains et des taux de gestation courts. La combinaison du génie génétique avec des outils de phénotypage à haut débit a permis la réplication et le diagnostic des malformations cardiaques structurelles afin d’élucider davantage les voies moléculaires derrière les maladies coronariennes. L’utilisation de l’échocardiographie fœtale non invasive pour dépister les phénotypes cardiaques dans des modèles murins, associée à la haute fidélité de la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de l’histopathologie de microscopie confocale épiscopique (ECM) avec reconstructions tridimensionnelles (3D) permet une vue détaillée de l’anatomie de diverses malformations cardiaques congénitales. Ce protocole décrit un flux de travail complet de ces méthodes pour obtenir un diagnostic précis des malformations cardiaques congénitales murines. L’application de ce protocole de phénotypage à des organismes modèles permettra un diagnostic précis de coronaropathie, ce qui permettra de mieux comprendre les mécanismes de la coronaropathie. L’identification des mécanismes sous-jacents de la coronaropathie offre des possibilités de thérapies et d’interventions potentielles.
Introduction
Les cardiopathies congénitales (cardiopathies) sont l’anomalie congénitale néonatale la plus courante 1,2, touchant environ 0,8 % à 1,7 % des nouveau-nés et entraînant une mortalité et une morbidité néonatales importantes3. Une étiologie génétique est fortement indiquée avec les cardiopathies congénitales 4,5. Les modèles murins génétiquement modifiés ont été largement utilisés pour comprendre la complexité des maladies coronariennes et les mécanismes qui les provoquent en raison du fait que les souris ont des cœurs à quatre cha....
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Protocole
L’utilisation de souris pour ces études est nécessaire car les souris ont des cœurs à quatre chambres qui peuvent imiter les cardiopathies congénitales humaines. Les souris ont reçu des soins vétérinaires et ont été hébergées dans l’établissement de soins aux animaux accrédité par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) de l’établissement. Des protocoles stricts ont été suivis pour minimiser l’inconfort, le stress, la douleur et les blessures des souris. Des souris ont été euthanasiées à l’aide de gaz CO2 , ce qui est acceptable pour les petits rongeurs selon les directives de l’American Veterinary Medical Associati....
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Résultats
Les embryons de souris présentant des défauts hémodynamiques importants ont été notés comme étant létaux embryonnaire. Une grande variété de maladies coronariennes peut être identifiée grâce à l’échocardiogramme fœtal non invasif à haut rendement en utilisant différentes vues (Figure 1).
Anomalies septales : Les cardiopathies congénitales les plus courantes sont les anomalies septales telles qu’une communication interventriculaire (VSD), une commu.......
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Discussion
Des souris génétiquement modifiées ont été utilisées pour comprendre les mécanismes pathologiques des malformations cardiaques congénitales. Les protocoles que nous fournissons dans cette étude tentent de rationaliser et de normaliser le processus d’évaluation des malformations cardiaques fœtales murines. Cependant, il y a des étapes critiques à noter pendant le protocole. Les embryons de souris se développent de manière significative au cours de chaque jour de gestation, et le moment correct pour récolter une souris peu.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts dans ce manuscrit.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1,5 mL Tubes Eppendorf (ou flacon préféré pour le stockage des tissus) | SealRite | 1615-5599 | |
| Solution de phosphate de formol tamponnée à 10 % | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100 | éthanol Decon Laboratories | 2701 | |
| 16 % paraformaldéhyde (PFA) fixateur ; | ThermoScientific | 28908 | 4 % de concentration de travail fraîchement préparé dans 1x PBS à 4 ° ; C |
| Tubes de 50 mL | Falcon | 352070 | |
| 6&ndash ; Plaque à 12 puits ou flacon de 20 mL pour stockage d’embryons | Falcon | 353046 | |
| microscope de dissection. | Leica | MDG36 | |
| (grade A1 ou A2) | F.S.T | 26002-15 | |
| Plaque de dissectionnement ; | F.S.T | FB0875713 | Boîte de Pétri avec base de paraffine |
| Moules d’enrobage | Sakura | 4133 | |
| Ciseaux extra étroits (10,5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1&ndash ; 2 paires ; |
| Fidji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Pointe fine (0,05 mm x 0,01 mm) Pince à dissection (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 paires |
| Pinces chaudes ; | F.S.T | 11252-00 | Pour l’orientation des embryons |
| Marqueur industriel pour blocs de cire ; | Sharpie | 2003898 | Formaté pour une utilisation en laboratoire |
| Caméra microscope Jenoptik ProgRes C14plus ; | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro logiciel d’acquisition | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Grand bécher en verre ; | Fisher Scientific | S111053 | Pour la paroftine de fusion |
| Microscope binoculaire Leica M165 FC (optique zoom 16,5:1) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com ; | |
| Paraplast encastrable cire de paraffine | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Petit bécher en verre | Fisher Scientific | S111045 | |
| Petite cuillère perforée (14,5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Ciseaux Vannas droits (4&ndash ; 8 mm) | F.S.T | 15018-10 | Une paire |
| biomicroscopes à ultrasons ultra-haute fréquence Vevo2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylène | Fisher Chemical | UN1307 |
Références
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al.
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Réimpressions et autorisations
