Анализ пустоты в реальном времени

Summary

В этой статье описывается новый метод изучения поведения мышей при мочеиспускании путем включения видеомониторинга в обычный анализ пятен пустоты. Этот подход предоставляет временную, пространственную и объемную информацию о событиях мочеиспускания и деталях поведения мышей во время светлых и темных фаз дня.

Abstract

Нормальное мочеиспускание является результатом скоординированной функции мочевого пузыря, уретры и сфинктеров уретры под надлежащим контролем нервной системы. Чтобы изучить поведение произвольного мочеиспускания на мышиных моделях, исследователи разработали анализ пятен пустот (VSA), метод, который измеряет количество и площадь пятен мочи, нанесенных на фильтровальную бумагу, выстилающую пол клетки животного. Несмотря на то, что технически этот анализ прост и недорог, он имеет ограничения при использовании в качестве конечного анализа, включая отсутствие временного разрешения событий мочеиспускания и трудности с количественной оценкой перекрывающихся пятен мочи. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали VSA с видеомониторингом, который мы называем VSA В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (RT-VSA), и который позволяет нам определять частоту мочеиспускания, оценивать объем мочеиспускания и характер мочеиспускания, а также проводить измерения в течение 6-часовых временных окон как в темную, так и в светлую фазы дня. Метод, описанный в этом отчете, может быть применен к широкому спектру исследований на мышах, которые изучают физиологические и нейроповеденческие аспекты произвольного мочеиспускания при состояниях здоровья и болезнях.

Introduction

Хранение мочи и мочеиспускание координируются центральной схемой (центральной нервной системой), которая получает информацию о состоянии наполнения мочевого пузыря через тазовый и подчревный нервы. Уротелий, эпителий, который выстилает мочевыводящие пути от почечной лоханки до проксимального отдела уретры, образует плотный барьер для продуктов метаболизма и патогенов, присутствующих в моче. Это неотъемлемый компонент сенсорной сети, которая ощущает и сообщает о состоянии наполнения мочевого пузыря подлежащим тканям и афферентным нервам ^1,2. Нарушение уротелиального барьера или изменения в путях механотрансдукции уротелия могут привести к дисфункции мочеиспускания наряду с симптомами нижних мочевыводящих путей, такими как частота, срочность, никтурия и недержание мочи 3,4,5,6,7. Точно так же известно, что старение, диабет, инфекции нижних мочевыводящих путей, интерстициальный цистит и другие болезненные процессы, которые влияют на мочевой пузырь или связанную с ним схему, контролирующую его функцию, вызывают дисфункцию мочевого пузыря 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17^{, 18,19}. Лучшее понимание нормального и ненормального поведения при мочеиспускании зависит от разработки методов, которые могут надежно различать различные модели мочеиспускания.

Традиционно поведение мышей при произвольном мочеиспускании изучалось с использованием анализа пятен мочеиспускания (VSA), разработанного Дежарденом и его коллегами 20 и получившего широкое распространение благодаря своей простоте, низкой стоимости и неинвазивному подходу 8,21,22,23,24. Этот анализ обычно проводится в виде конечного анализа, при котором мышь проводит определенное количество времени в клетке, выстланной фильтровальной бумагой, которая впоследствии анализируется путем подсчета количества и оценки размера пятен мочи, когда фильтровальная бумага помещается под ультрафиолетовый (УФ) свет (пятна мочи флуоресцируют в этих условиях)²⁰. Несмотря на эти многочисленные преимущества, традиционная VSA имеет некоторые серьезные ограничения. Поскольку мыши часто мочатся в одних и тех же областях, исследователи должны ограничить продолжительность анализа относительно коротким периодом времени (≤4 часа)²⁵. Даже когда VSA выполняется в течение более коротких периодов времени, практически невозможно устранить небольшие пустотные пятна (SVS), которые падают на большие пустоты, или отличить SVS от переноса мочи, прилипшей к хвостам или лапам. Также очень трудно различить, являются ли SVS следствием частых, но индивидуальных событий мочеиспускания (фенотип, который часто наблюдается в ответ на цистит 4,26) или из-за постмиктуриции (фенотип^, связанный с обструкцией выходного отверстия мочевого пузыря ²⁷). Кроме того, желание завершить анализ в рабочее время в сочетании с трудностями доступа к жилым помещениям при выключенном свете часто ограничивает эти анализы световым периодом 24-часового циркадного цикла. Таким образом, эти временные ограничения препятствуют оценке поведения мышей во время их активной ночной фазы, уменьшая способность анализировать конкретные гены или методы лечения, которые регулируются циркадными ритмами.

Чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, исследователи разработали альтернативные методы оценки поведения мочеиспускания в режиме реального времени 26,28,29,30,31,32. Некоторые из этих подходов предполагают использование дорогостоящего оборудования, такого как метаболические клетки^26,28,29, или использование тепловизионных камер³⁰; Однако у них тоже есть ограничения. Например, в метаболических клетках моча имеет тенденцию прилипать к проводам сетчатого пола и к стенкам воронки, уменьшая количество собираемой и измеряемой мочи. Таким образом, может быть сложно точно собрать данные о небольших пустотах. Кроме того, метаболические клетки не предоставляют информацию о пространственном распределении событий мочеиспускания (т.е. мочеиспускания в углах по сравнению с центром камеры). Учитывая, что длинноволновое инфракрасное излучение, используемое термографическими камерами, не проникает в твердые тела, активность мочеиспускания, оцениваемая с помощью видеотермографии, должна выполняться в открытой системе, что может быть сложно с активными мышами, поскольку они могут подпрыгивать на несколько дюймов в воздухе. Другой системой является автоматизированный подход³³ для удаления пятен на бумаге (aVSOP), который состоит из рулонной фильтровальной бумаги, которая с постоянной скоростью наматывается под полом клетки для мыши из проволочной сетки. Такой подход предотвращает повреждение бумаги и наложение пятен мочи, которые происходят при классическом VSA, и его реализация позволяет исследователю проводить эксперименты в течение нескольких дней. Тем не менее, он не дает исследователю точного времени событий мочеиспускания, и нет возможности изучить поведение и то, как оно коррелирует с кровянистыми выделениями. Чтобы получить эту информацию, исследователи включили видеомониторинг в анализы мочеиспускания, подход, который позволяет одновременно оценивать активность мыши и события мочеиспускания^31,32. Один из подходов состоит в размещении синего светоизлучающего диода (LED) и видеокамеры с зеленым флуоресцентным белковым фильтром, установленным под экспериментальной клеткой для визуализации событий мочеиспускания, а также инфракрасного светодиода и видеокамеры над клеткой для захвата положения^{мыши 32}. Эта установка использовалась для мониторинга поведения мочеиспускания при выполнении фотометрии волокна; Однако ярко освещенная среда этой системы требовала от исследователей лечения своих мышей мочегонным агентом для стимуляции мочеиспускания. В другом экспериментальном проекте широкоугольные камеры были размещены над и под экспериментальной клеткой для визуализации двигательной активности мыши и событий мочеиспускания соответственно. В этом случае пятна мочи, осевшие на фильтровальной бумаге, выстилающей пол клетки, были выявлены путем освещения фильтровальной бумаги ультрафиолетовыми лучами, помещенными под клетку³¹. Эта установка использовалась в коротких анализах, продолжительностью 4 минуты, во время световой фазы дня для изучения нейронов ствола мозга, участвующих в произвольном мочеиспускании³¹. О пригодности этой системы для ее использования во время темновой фазы или в течение периодов времени >4 мин не сообщалось.

В этой статье описан метод, который усиливает традиционный VSA, позволяя осуществлять долгосрочный видеомониторинг поведения мышей при мочеиспускании. Этот экономически эффективный подход предоставляет временную, пространственную и объемную информацию о событиях мочеиспускания в течение длительных периодов времени в течение светлых и темных фаз дня, а также подробности, связанные с поведением мышей 3,4,34. Предоставляется подробная информация о строительстве камер пустотирования, внедрении VSA В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (RT-VSA) и анализе данных. RT-VSA ценен для исследователей, стремящихся понять физиологические механизмы, контролирующие функцию мочевыделительной системы, разработать фармакологические подходы к контролю мочеиспускания и определить молекулярную основу патологических процессов, влияющих на нижние мочевыводящие пути.

Protocol

Уротелиальные пьезо1 /2 мыши с двойным нокаутом (Pz1/2-KO, генотип: Piezo1 fl/fl; Пьезо2 фл/фл; Upk2CRE+/-) и контроль (Pz1/2-C, генотип: Piezo1 fl/fl; Пьезо2 фл/фл; Upk2CRE-/-) были получены собственными силами из родительских штаммов, полученных в лабораториях Jax (штам…

Representative Results

Мочеиспускание уротелиальных мышей с нокаутом Piezo1/2 Предполагается, что во время фазы накопления цикла мочеиспускания уротелий ощущает напряжение, оказываемое мочой, накопленной в мочевом пузыре, и преобразует этот механический стимул в клеточные реакци?…

Discussion

Включение видеонаблюдения является экономически эффективной модификацией, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с классическим VSA. В классическом VSA, который обычно используется в качестве анализа конечной точки, трудно различить перекрывающиеся пустоты. Это нетривиальная проб?…

Materials

1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots –  cut to 10 inches	80/20	1010	Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots –  cut to 12 inches	80/20	1010	Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots –  cut to 40 inches	80/20	1010	Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches	80/20	1010	Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 32 inches	80/20	1010	Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut	80/20	3280	Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut	80/20	3287	Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole – 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support	80/20	14061	Amount: 6
10 Series 3 Hole – Straight Flat Plate	80/20	4118	Amount: 8
10 Series 5 Hole – "L" Flat Plate	80/20	4081	Amount: 8
10 Series 5 Hole – "T" Flat Plate	80/20	4080	Amount: 8
10 Series 5 Hole – Tee Flat Plate	80/20	4140	Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge – Right Hand Assembly	80/20	2064	Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole – Lite Transition Inside Corner Bracket	80/20	4509	Amount: 6
24”-long UV tube lights	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos blotting paper (thick paper)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.4.0	graphing and statistics software
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		transparent film
Quick Time Player 10.5 software	Apple		multimedia player
Security spy	Ben software		video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20	80/20	3381	Amount: 80
UV transmitting acrylic	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm
Water gel: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Amount: 4