Генерация и визуализация эпителиальных органоидов мыши и человека из нормальной и опухолевой ткани молочной железы без пассажа
Summary
В этом протоколе обсуждается подход к получению эпителиальных органоидов из первичной нормальной и опухолевой ткани молочной железы посредством дифференциального центрифугирования. Кроме того, включены инструкции по трехмерному культивированию, а также иммунофлуоресцентной визуализации встроенных органоидов.
Abstract
Органоиды являются надежным методом моделирования ткани органа благодаря своим самоорганизующимся свойствам и сохранению функции и архитектуры после размножения из первичной ткани или стволовых клеток. Этот метод генерации органоидов отказывается от дифференцировки одноклеточных клеток через несколько пассажей и вместо этого использует дифференциальное центрифугирование для выделения органоидов эпителия молочной железы из механически и ферментативно диссоциированных тканей. Этот протокол обеспечивает оптимизированную технику быстрого получения мелких и крупных эпителиальных органоидов как из ткани молочной железы мыши, так и из ткани молочной железы человека в дополнение к методам встраивания органоидов в коллаген и базис внеклеточного матрикса. Кроме того, приведены инструкции по фиксации в геле и иммунофлуоресцентному окрашиванию с целью визуализации морфологии и плотности органоидов. Эти методологии подходят для множества последующих анализов, таких как совместное культивирование с иммунными клетками и моделирование метастазов ex vivo с помощью анализа инвазии коллагена. Эти анализы служат для лучшего выяснения поведения клеток и создания более полного понимания взаимодействий в микроокружении опухоли.
Introduction
Способность моделировать эпителиальные клетки in vitro была основой современных биомедицинских исследований, поскольку она фиксирует клеточные особенности, которые недоступны in vivo. Например, выращивание эпителиальных клеточных линий в двумерной плоскости может дать оценку молекулярных изменений, происходящих в эпителиальной клетке во время пролиферации1. Кроме того, измерение динамической регуляции между передачей сигналов и экспрессией генов ограничено в системах in vivo 2. В исследованиях рака моделирование линии эпителиальных клеток рака позволило идентифицировать молекулярные драйверы прогрессирования заболевания и потенциальные мишени для лекарств3. Однако выращивание линий эпителиальных клеток рака в двумерной плоскости имеет ограничения, поскольку большинство из них генетически иммортализированы и модифицированы, часто клональны по своей природе, отобраны по их способности расти в нефизиологических условиях, ограничены в оценке трехмерной (3D) архитектуры опухолевой ткани и не адекватно моделируют взаимодействия микроокружения в реалистичной тканевой среде4. Эти ограничения особенно очевидны при моделировании метастазирования, которое in vivo включает в себя несколько различных биологических стадий, включая инвазию, распространение, циркуляцию и колонизацию в отдаленном участкеоргана 5.
Эпителиальные органоиды рака были разработаны для лучшего повторения 3D-среды и поведения опухолей 6,7,8. Органоиды были впервые разработаны из отдельных клеток кишечника LRG5+ и дифференцированы для представления 3D-структуры звеньев крипты-ворсинок, которые поддерживали иерархическую структуру тонкой кишки in vitro9. Этот подход позволил в режиме реального времени визуализировать и охарактеризовать самоорганизующуюся тканевую архитектуру в гомеостатических и стрессовых условиях. В качестве естественного расширения были разработаны органоиды эпителия рака для моделирования множества различных типов рака, включая колоректальный рак10, рак поджелудочной железы11, рак молочной железы12, печень13, легкие 14, мозг 15 и рак желудка16. Эпителиальные органоиды рака были использованы для характеристики эволюции рака17,18 и метастатического пространственно-временного поведения 19,20 и опроса гетерогенности опухоли 21 и тестирования химиотерапии 22. Раковые эпителиальные органоиды также были выделены и собраны во время текущих клинических испытаний для прогнозирования реакции пациента на противоопухолевые агенты и лучевую терапию ex vivo 8,23,24,25. Кроме того, системы, включающие раковые эпителиальные органоиды, могут быть объединены с другими нераковыми клетками, такими как иммунные клетки, для формирования более полной модели микроокружения опухоли для визуализации взаимодействий в режиме реального времени, раскрытия того, как раковые эпителиальные клетки изменяют фундаментальную природу цитотоксических эффекторных иммунных клеток, таких как естественные клетки-киллеры, и тестирования потенциальной иммунотерапии и антитело-лекарственной цитотоксической активности26, 27,28. В данной статье демонстрируется способ получения эпителиальных органоидов без пассажа и встраивания в коллаген и базальный внеклеточный матрикс (ECM). Кроме того, используются методы последующей визуализации изолированных органоидов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В литературе описаны различные методы получения опухолевых органоидов. В этом протоколе описывается метод получения опухолевых органоидов непосредственно из опухоли без пассажа. Используя этот метод, опухолевые органоиды могут быть получены в течение нескольких часов после начала п…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано финансированием, предоставленным METAvivor, Фондом Питера Карлсона, Исследовательским фондом Терезы и Онкологическим центром Симмонса NCI / UTSW P30 CA142543. Мы выражаем признательность за помощь Общему ресурсу по управлению юго-западными тканями Техасского университета, общему ресурсу в Комплексном онкологическом центре Симмонса, который частично поддерживается Национальным институтом рака под номером P30 CA142543. Особая благодарность всем членам Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
