توليد وتصوير الفئران والكائنات العضوية الظهارية البشرية من الأنسجة الثديية الطبيعية والأورام دون المرور
Summary
يناقش هذا البروتوكول نهجا لتوليد العضويات الظهارية من الأنسجة الثديية الطبيعية الأولية والأورام من خلال الطرد المركزي التفاضلي. علاوة على ذلك ، يتم تضمين تعليمات للزراعة ثلاثية الأبعاد وكذلك التصوير المناعي للعضويات المدمجة.
Abstract
تعتبر المواد العضوية طريقة موثوقة لنمذجة أنسجة الأعضاء نظرا لخصائصها ذاتية التنظيم والاحتفاظ بالوظيفة والبنية بعد الانتشار من الأنسجة الأولية أو الخلايا الجذعية. تتخلى طريقة توليد الخلايا العضوية هذه عن تمايز الخلية الواحدة من خلال ممرات متعددة وتستخدم بدلا من ذلك الطرد المركزي التفاضلي لعزل الكائنات العضوية الظهارية الثديية عن الأنسجة المنفصلة ميكانيكيا وإنزيميا. يوفر هذا البروتوكول تقنية مبسطة لإنتاج المواد العضوية الظهارية الصغيرة والكبيرة بسرعة من كل من أنسجة الفئران والأنسجة الثديية البشرية بالإضافة إلى تقنيات التضمين العضوي في الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية القاعدية. علاوة على ذلك ، يتم توفير تعليمات للتثبيت داخل الهلام وتلطيخ الفلورسنت المناعي لغرض تصور مورفولوجيا العضوية وكثافتها. هذه المنهجيات مناسبة لعدد لا يحصى من التحليلات النهائية ، مثل الزراعة المشتركة مع الخلايا المناعية ونمذجة ورم خبيث خارج الجسم الحي عبر مقايسة غزو الكولاجين. تعمل هذه التحليلات على توضيح سلوك الخلايا الخلوية بشكل أفضل وخلق فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات داخل البيئة المكروية للورم.
Introduction
كانت القدرة على نمذجة الخلايا الظهارية في المختبر أساس البحوث الطبية الحيوية الحديثة لأنها تلتقط الميزات الخلوية التي لا يمكن الوصول إليها في الجسم الحي. على سبيل المثال ، يمكن أن توفر خطوط الخلايا الظهارية المتنامية في مستوى ثنائي الأبعاد تقييما للتغيرات الجزيئية التي تحدث في الخلية الظهارية أثناء الانتشار1. علاوة على ذلك ، فإن قياس التنظيم الديناميكي بين الإشارات والتعبير الجيني محدود في أنظمة الجسم الحي 2. في أبحاث السرطان ، مكنت نمذجة خط الخلايا الظهارية السرطانية من تحديد الدوافع الجزيئية لتطور المرض وأهداف الأدوية المحتملة3. ومع ذلك ، فإن نمو خطوط الخلايا الظهارية السرطانية على مستوى ثنائي الأبعاد له قيود ، حيث أن معظمها يتم تخليده وتعديله وراثيا ، وغالبا ما يكون نسيليا بطبيعته ، ويتم اختياره لقدرته على النمو في ظروف غير فسيولوجية ، ومحدود في تقييمه لبنية أنسجة الورم ثلاثية الأبعاد (3D) ، ولا يقوم بنمذجة تفاعلات البيئة المكروية بشكل كاف داخل بيئة أنسجة واقعية4. هذه القيود واضحة بشكل خاص في نمذجة ورم خبيث ، والذي يتضمن في الجسم الحي عدة مراحل بيولوجية متميزة ، بما في ذلك الغزو والانتشار والدورة الدموية والاستعمار في موقع العضو البعيد5.
تم تطوير الكائنات العضوية الظهارية للسرطان لتلخيص بيئة 3D وسلوك الأورام6،7،8 بشكل أفضل. تم تطوير المواد العضوية لأول مرة من خلايا سرداب معوية LRG5 + مفردة ومتباينة لتمثيل البنية ثلاثية الأبعاد لوحدات crypt-villus التي حافظت على الهيكل الهرمي للأمعاء الدقيقة في المختبر9. سمح هذا النهج بالتصور والتوصيف في الوقت الفعلي لبنية الأنسجة ذاتية التنظيم في ظل ظروف الاستتباب والإجهاد. كامتداد طبيعي ، تم تطوير العضويات الظهارية للسرطان لنمذجة العديد من أنواع السرطان المختلفة ، بما في ذلك القولون والمستقيم 10 ، والبنكرياس 11 ، والثدي 12 ، والكبد 13 ، والرئة 14 ، والدماغ 15 ، وسرطان المعدة 16. تم استغلال العضويات الظهارية السرطانية لتوصيف تطور السرطان17,18 والسلوكيات الزمانية المكانيةالنقيلي 19,20 واستجواب عدم تجانس الورم 21 ، واختبار العلاجات الكيميائية 22. كما تم عزل الكائنات العضوية الظهارية للسرطان وجمعها خلال التجارب السريرية الجارية للتنبؤ باستجابة المريض للعوامل المضادة للسرطان والعلاج الإشعاعي خارج الجسم الحي8،23،24،25. علاوة على ذلك ، يمكن دمج الأنظمة التي تتضمن عضويات ظهارية سرطانية مع خلايا أخرى غير سرطانية ، مثل الخلايا المناعية ، لتشكيل نموذج أكثر شمولا للبيئة المكروية للورم لتصور التفاعلات في الوقت الفعلي ، والكشف عن كيفية تغيير الخلايا الظهارية السرطانية للطبيعة الأساسية للخلايا المناعية المستجيبة السامة للخلايا مثل الخلايا القاتلة الطبيعية ، واختبار العلاجات المناعية المحتملة والنشاط السام للخلايا المعتمد على الأجسام المضادة26 ، 27,28. توضح هذه المقالة طريقة لتوليد المواد العضوية الظهارية دون المرور والتضمين في الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية القاعدية (ECM). بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا مشاركة تقنيات التصوير النهائي للعضويات المعزولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم وصف طرق مختلفة في الأدبيات لتوليد عضويات الورم. يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة لتوليد عضويات الورم مباشرة من الورم دون المرور. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن إنتاج عضويات الورم في غضون ساعات من بدء الإجراء وتوليد ما يقرب من 100٪ من المواد العضوية القابلة للحياة مقارنة ب 70٪ المبلغ عنها ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بتمويل مقدم من METAvivor ، و Peter Carlson Trust ، ومؤسسة أبحاث تيريزا ، ومركز NCI/UTSW Simmons للسرطان P30 CA142543. نحن نعترف بمساعدة المورد المشترك لإدارة الأنسجة بجامعة تكساس الجنوبية الغربية ، وهو مورد مشترك في مركز سيمونز الشامل للسرطان ، والذي يدعمه جزئيا المعهد الوطني للسرطان بموجب رقم الجائزة P30 CA142543. شكر خاص لجميع أعضاء مختبر تشان.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
