Generering og avbildning av mus og humane epitelorganoider fra normalt og tumorbrystvev uten å passere
Summary
Denne protokollen diskuterer en tilnærming for å generere epitelorganoider fra primær normal og tumor brystvev gjennom differensial sentrifugering. Videre er instruksjoner inkludert for tredimensjonal dyrking samt immunfluorescerende avbildning av innebygde organoider.
Abstract
Organoider er en pålitelig metode for modellering av organvev på grunn av deres selvorganiserende egenskaper og oppbevaring av funksjon og arkitektur etter forplantning fra primærvev eller stamceller. Denne metoden for organoid generering avstår fra enkeltcelledifferensiering gjennom flere passasjer og bruker i stedet differensiell sentrifugering for å isolere brystepitelorganoider fra mekanisk og enzymatisk dissosierte vev. Denne protokollen gir en strømlinjeformet teknikk for raskt å produsere små og store epitelorganoider fra både mus og humant brystvev i tillegg til teknikker for organoidinnebygging i kollagen og kjeller ekstracellulær matrise. Videre er instruksjoner for fiksering av gel og immunfluorescerende farging gitt med det formål å visualisere organoid morfologi og tetthet. Disse metodene er egnet for utallige nedstrømsanalyser, for eksempel samdyrking med immunceller og ex vivo metastasemodellering via kollageninvasjonsanalyse. Disse analysene tjener til å bedre belyse cellecellenes oppførsel og skape en mer fullstendig forståelse av interaksjoner i tumormikromiljøet.
Introduction
Evnen til å modellere epitelceller in vitro har vært grunnlaget for moderne biomedisinsk forskning fordi den fanger opp cellulære egenskaper som ikke er tilgjengelige in vivo. For eksempel kan voksende epitelcellelinjer i et todimensjonalt plan gi en vurdering av molekylære endringer som forekommer i en epitelcelle under proliferasjon1. Videre er måling av dynamisk regulering mellom signalering og genuttrykk begrenset i in vivo-systemer 2. I kreftforskning har kreftepitelcellelinjemodellering gjort det mulig å identifisere molekylære drivere for sykdomsprogresjon og potensielle legemiddelmål3. Imidlertid har voksende kreftepitelcellelinjer på et todimensjonalt plan begrensninger, da de fleste er genetisk udødeliggjort og modifisert, ofte klonale i naturen, valgt for deres evne til å vokse i ikke-fysiologiske forhold, begrenset i deres vurdering av tredimensjonal (3D) tumorvevsarkitektur, og ikke tilstrekkelig modellere mikromiljøinteraksjoner i et realistisk vevsmiljø4. Disse begrensningene er spesielt tydelige i modelleringsmetastase, som in vivo inkluderer flere distinkte biologiske stadier, inkludert invasjon, formidling, sirkulasjon og kolonisering på det fjerne organstedet5.
Kreftepitelorganoider er utviklet for bedre å rekapitulere 3D-miljøet og oppførselen til svulster 6,7,8. Organoider ble først utviklet fra enkle LRG5+ tarmkryptceller og differensiert for å representere 3D-strukturen til krypt-villus-enheter som opprettholdt tynntarmens hierarkiske struktur in vitro9. Denne tilnærmingen tillot sanntidsvisualisering og karakterisering av selvorganiserende vevsarkitektur under homeostatiske og stressforhold. Som en naturlig forlengelse ble kreftepitelorganoider utviklet for å modellere mange forskjellige krefttyper, inkludert kolorektal10, bukspyttkjertel 11, bryst 12, lever 13, lunge 14, hjerne 15 og magekreft 16. Kreftepitelorganoider har blitt utnyttet til å karakterisere kreftutvikling17,18 og metastatisk spatiotemporal atferd 19,20 og forhøre tumorheterogenitet 21 og teste kjemoterapier 22. Kreftepitelorganoider har også blitt isolert og samlet under pågående kliniske studier for å forutsi pasientrespons på kreftmidler og strålebehandling ex vivo 8,23,24,25. Videre kan systemer som inneholder kreftepitelorganoider kombineres med andre ikke-kreftceller, for eksempel immunceller, for å danne en mer omfattende modell av tumormikromiljøet for å visualisere interaksjoner i sanntid, avdekke hvordan kreftepitelceller endrer den grunnleggende naturen til cytotoksiske effektorimmunceller som naturlige drepeceller, og teste potensielle immunterapier og antistoff-legemiddelavhengig cytotoksisk aktivitet26, 27,28. Denne artikkelen demonstrerer en metode for å generere epitelorganoider uten å passere og legge inn i kollagen og kjeller ekstracellulær matrise (ECM). I tillegg deles teknikker for nedstrøms avbildning av isolerte organoider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ulike metoder har blitt beskrevet i litteraturen for å generere tumororganoider. Denne protokollen fremhever en metode for å generere tumororganoider direkte fra svulsten uten å passere. Ved hjelp av denne metoden er tumororganoider produserbare innen timer etter initiering av prosedyren og genererer nær 100% levedyktige organoider sammenlignet med 70% rapportert i litteraturen31. Til sammenligning krever andre metoder seriell passasje av celler til organoider over flere uker. Dermed blir neds…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av finansiering fra METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa’s Research Foundation og NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Vi anerkjenner assistansen fra University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, en delt ressurs ved Simmons Comprehensive Cancer Center, som delvis støttes av National Cancer Institute under tildelingsnummer P30 CA142543. Spesiell takk til alle medlemmer av Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
