Denne protokollen diskuterer en tilnærming for å generere epitelorganoider fra primær normal og tumor brystvev gjennom differensial sentrifugering. Videre er instruksjoner inkludert for tredimensjonal dyrking samt immunfluorescerende avbildning av innebygde organoider.
Organoider er en pålitelig metode for modellering av organvev på grunn av deres selvorganiserende egenskaper og oppbevaring av funksjon og arkitektur etter forplantning fra primærvev eller stamceller. Denne metoden for organoid generering avstår fra enkeltcelledifferensiering gjennom flere passasjer og bruker i stedet differensiell sentrifugering for å isolere brystepitelorganoider fra mekanisk og enzymatisk dissosierte vev. Denne protokollen gir en strømlinjeformet teknikk for raskt å produsere små og store epitelorganoider fra både mus og humant brystvev i tillegg til teknikker for organoidinnebygging i kollagen og kjeller ekstracellulær matrise. Videre er instruksjoner for fiksering av gel og immunfluorescerende farging gitt med det formål å visualisere organoid morfologi og tetthet. Disse metodene er egnet for utallige nedstrømsanalyser, for eksempel samdyrking med immunceller og ex vivo metastasemodellering via kollageninvasjonsanalyse. Disse analysene tjener til å bedre belyse cellecellenes oppførsel og skape en mer fullstendig forståelse av interaksjoner i tumormikromiljøet.
Evnen til å modellere epitelceller in vitro har vært grunnlaget for moderne biomedisinsk forskning fordi den fanger opp cellulære egenskaper som ikke er tilgjengelige in vivo. For eksempel kan voksende epitelcellelinjer i et todimensjonalt plan gi en vurdering av molekylære endringer som forekommer i en epitelcelle under proliferasjon1. Videre er måling av dynamisk regulering mellom signalering og genuttrykk begrenset i in vivo-systemer 2. I kreftforskning har kreftepitelcellelinjemodellering gjort det mulig å identifisere molekylære drivere for sykdomsprogresjon og potensielle legemiddelmål3. Imidlertid har voksende kreftepitelcellelinjer på et todimensjonalt plan begrensninger, da de fleste er genetisk udødeliggjort og modifisert, ofte klonale i naturen, valgt for deres evne til å vokse i ikke-fysiologiske forhold, begrenset i deres vurdering av tredimensjonal (3D) tumorvevsarkitektur, og ikke tilstrekkelig modellere mikromiljøinteraksjoner i et realistisk vevsmiljø4. Disse begrensningene er spesielt tydelige i modelleringsmetastase, som in vivo inkluderer flere distinkte biologiske stadier, inkludert invasjon, formidling, sirkulasjon og kolonisering på det fjerne organstedet5.
Kreftepitelorganoider er utviklet for bedre å rekapitulere 3D-miljøet og oppførselen til svulster 6,7,8. Organoider ble først utviklet fra enkle LRG5+ tarmkryptceller og differensiert for å representere 3D-strukturen til krypt-villus-enheter som opprettholdt tynntarmens hierarkiske struktur in vitro9. Denne tilnærmingen tillot sanntidsvisualisering og karakterisering av selvorganiserende vevsarkitektur under homeostatiske og stressforhold. Som en naturlig forlengelse ble kreftepitelorganoider utviklet for å modellere mange forskjellige krefttyper, inkludert kolorektal10, bukspyttkjertel 11, bryst 12, lever 13, lunge 14, hjerne 15 og magekreft 16. Kreftepitelorganoider har blitt utnyttet til å karakterisere kreftutvikling17,18 og metastatisk spatiotemporal atferd 19,20 og forhøre tumorheterogenitet 21 og teste kjemoterapier 22. Kreftepitelorganoider har også blitt isolert og samlet under pågående kliniske studier for å forutsi pasientrespons på kreftmidler og strålebehandling ex vivo 8,23,24,25. Videre kan systemer som inneholder kreftepitelorganoider kombineres med andre ikke-kreftceller, for eksempel immunceller, for å danne en mer omfattende modell av tumormikromiljøet for å visualisere interaksjoner i sanntid, avdekke hvordan kreftepitelceller endrer den grunnleggende naturen til cytotoksiske effektorimmunceller som naturlige drepeceller, og teste potensielle immunterapier og antistoff-legemiddelavhengig cytotoksisk aktivitet26, 27,28. Denne artikkelen demonstrerer en metode for å generere epitelorganoider uten å passere og legge inn i kollagen og kjeller ekstracellulær matrise (ECM). I tillegg deles teknikker for nedstrøms avbildning av isolerte organoider.
Ulike metoder har blitt beskrevet i litteraturen for å generere tumororganoider. Denne protokollen fremhever en metode for å generere tumororganoider direkte fra svulsten uten å passere. Ved hjelp av denne metoden er tumororganoider produserbare innen timer etter initiering av prosedyren og genererer nær 100% levedyktige organoider sammenlignet med 70% rapportert i litteraturen31. Til sammenligning krever andre metoder seriell passasje av celler til organoider over flere uker. Dermed blir neds…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av finansiering fra METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa’s Research Foundation og NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Vi anerkjenner assistansen fra University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, en delt ressurs ved Simmons Comprehensive Cancer Center, som delvis støttes av National Cancer Institute under tildelingsnummer P30 CA142543. Spesiell takk til alle medlemmer av Chan Lab.
10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
10x DMEM | Sigma | D2429 | |
50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
bFGF | Sigma | F0291 | |
BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
Collagenase A | Sigma | C2139 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
Insulin | Sigma | #I9278 | |
Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |