Generera och avbilda mus- och humana epitelorganoider från normal och tumörbröstvävnad utan att passera
Summary
Detta protokoll diskuterar ett tillvägagångssätt för att generera epitelorganoider från primär normal och tumörbröstvävnad genom differentiell centrifugering. Vidare ingår instruktioner för tredimensionell odling samt immunofluorescerande avbildning av inbäddade organoider.
Abstract
Organoider är en pålitlig metod för modellering av organvävnad på grund av deras självorganiserande egenskaper och bibehållande av funktion och arkitektur efter förökning från primärvävnad eller stamceller. Denna metod för organoidgenerering avstår från encellsdifferentiering genom flera passager och använder istället differentiell centrifugering för att isolera bröstepitelorganoider från mekaniskt och enzymatiskt dissocierade vävnader. Detta protokoll ger en strömlinjeformad teknik för att snabbt producera små och stora epitelorganoider från både mus och mänsklig bröstvävnad utöver tekniker för organoidinbäddning i kollagen och extracellulär matris i källaren. Vidare tillhandahålls instruktioner för in-gelfixering och immunofluorescerande färgning i syfte att visualisera organoidmorfologi och densitet. Dessa metoder är lämpliga för otaliga nedströmsanalyser, såsom samodling med immunceller och ex vivo-metastasmodellering via kollageninvasionsanalys. Dessa analyser tjänar till att bättre belysa cell-cellbeteende och skapa en mer fullständig förståelse för interaktioner inom tumörmikromiljön.
Introduction
Möjligheten att modellera epitelceller in vitro har varit grunden för modern biomedicinsk forskning eftersom den fångar cellulära egenskaper som inte är tillgängliga in vivo. Till exempel kan växande epitelcellinjer i ett tvådimensionellt plan ge en bedömning av de molekylära förändringar som uppstår i en epitelcell under proliferation1. Dessutom är mätning av den dynamiska regleringen mellan signalering och genuttryck begränsad i in vivo-system 2. Inom cancerforskning har cancerepitelial cellinjemodellering möjliggjort identifiering av molekylära drivkrafter för sjukdomsprogression och potentiella läkemedelsmål3. Växande cancerepitelcellinjer på ett tvådimensionellt plan har emellertid begränsningar, eftersom de flesta är genetiskt odödliga och modifierade, ofta klonala i naturen, utvalda för sin förmåga att växa under icke-fysiologiska förhållanden, begränsade i sin bedömning av tredimensionell (3D) tumörvävnadsarkitektur och inte tillräckligt modellerar mikromiljöinteraktioner inom en realistisk vävnadsmiljö4. Dessa begränsningar är särskilt tydliga vid modellering av metastaser, som in vivo inkluderar flera distinkta biologiska stadier, inklusive invasion, spridning, cirkulation och kolonisering vid den avlägsna organplatsen5.
Cancer epitelorganoider har utvecklats för att bättre rekapitulera 3D-miljön och beteendet hos tumörer 6,7,8. Organoider utvecklades först från enstaka LRG5 + intestinala kryptceller och differentierades för att representera 3D-strukturen hos krypt-villusenheter som upprätthöll tunntarmens hierarkiska struktur in vitro 9. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde visualisering och karakterisering i realtid av självorganiserande vävnadsarkitektur under homeostatiska och stressförhållanden. Som en naturlig förlängning utvecklades cancerepitelorganoider för att modellera många olika cancertyper, inklusive kolorektal 10, bukspottskörtel 11, bröst 12, lever 13, lunga14, hjärna 15 och magcancer 16. Cancerepitelorganoider har utnyttjats för att karakterisera cancerutveckling17,18 och metastaserande spatiotemporala beteenden 19,20 och förhöra tumörheterogenitet 21 och testa kemoterapier 22. Cancerepitelorganoider har också isolerats och samlats in under pågående kliniska prövningar för att förutsäga patientens svar på cancerläkemedel och strålbehandling ex vivo 8,23,24,25. Vidare kan system som innehåller cancerepitelorganoider kombineras med andra icke-cancerceller, såsom immunceller, för att bilda en mer omfattande modell av tumörmikromiljön för att visualisera interaktioner i realtid, avslöja hur cancerepitelceller förändrar den grundläggande karaktären hos cytotoxiska effektorimmunceller, såsom naturliga mördarceller, och testa potentiella immunterapier och antikroppsberoende cytotoxisk aktivitet26, 27,28. Denna artikel demonstrerar en metod för att generera epitelorganoider utan att passera och bädda in i kollagen och källare extracellulär matris (ECM). Dessutom delas tekniker för nedströms avbildning av isolerade organoider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Olika metoder har beskrivits i litteraturen för att generera tumörorganoider. Detta protokoll belyser en metod för att generera tumörorganoider direkt från tumören utan att passera. Med hjälp av denna metod produceras tumörorganoider inom några timmar efter att proceduren initierats och genererar nära 100% livskraftiga organoider jämfört med 70% som rapporterats i litteraturen31. I jämförelse kräver andra metoder seriell passaging av celler i organoider under flera veckor. Således …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av finansiering från METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa’s Research Foundation och NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Vi erkänner hjälpen från University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, en delad resurs vid Simmons Comprehensive Cancer Center, som delvis stöds av National Cancer Institute under tilldelningsnummer P30 CA142543. Särskilt tack till alla medlemmar i Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
