في عدوى الميكوبلازما الرئوية ، يمكن أن تؤدي اختبارات الأمصال إلى نتائج جيدة ، ولكن مع خصوصية منخفضة بسبب التفاعل المتقاطع المناعي. يضمن ELISA الذي يلتقط المستضد الداخلي ، الموصوف في هذه الورقة ، خصوصية عالية للأنواع وقد ثبت أنه اختبار فحص موثوق به للتشخيص الدقيق للمتفطرة الرئوية.
الميكوبلازما الرئوية هي بدائية النواة التي تعاني من نقص جدار الخلية ، والمعروفة أساسا باستعمار الجهاز التنفسي البشري وأنها مستوطنة ، مع ذروة وبائية كل 6 سنوات ، في الأطفال الأكبر سنا والشباب. يمثل تشخيص المتفطرة الرئوية تحديا بسبب الطبيعة السريعة للممرض وإمكانية النقل بدون أعراض. لا يزال التشخيص المختبري لعدوى المتفطرة الرئوية على أساس معايرة الأجسام المضادة في عينات مصل المرضى هو الطريقة الأكثر ممارسة. بسبب المشكلة المحتملة للتفاعل المناعي المتبادل مع استخدام مصل متعدد النسيلة للمتفطرة الرئوية ، تم تطوير مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد (ELISA) لتحسين خصوصية التشخيص المصلي. يتم طلاء صفائح ELISA بأجسام مضادة متعددة النسيلة M. pneumoniae ، يتم تربيتها في الأرانب وتصبح محددة بعد الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة التي تشترك في المستضدات مع أنواع M. pneumoniae و / أو من المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي . ثم يتم التعرف على المستضدات المتماثلة المتفاعلة M. pneumoniae على وجه التحديد من خلال الأجسام المضادة المقابلة لها في عينات المصل. أدى المزيد من التحسين للمعلمات الفيزيائية والكيميائية التي يتعرض لها ELISA لالتقاط المستضد إلى ELISA محدد للغاية وحساس وقابل للتكرار.
الميكوبلازما هي من بين أصغر وأبسط بدائيات النوى المعروفة. تتميز بشكل أساسي عن البكتيريا الأخرى بعدم وجود بنية جدار الخلية. وهكذا ، تم تصنيف الميكوبلازما في فئة منفصلة تسمى Mollicutes1. يمنح نقص جدار الخلية مقاومة جوهرية لهذه الكائنات الحية الدقيقة ضد بعض العوامل المضادة للميكروبات وهو مسؤول إلى حد كبير عن تعدد أشكالها. الميكوبلازما لها جينوم صغير وحجم منخفض ، مما يحد من قدراتها الأيضية والاصطناعية الحيوية ويفسر طبيعتها الطفيلية والرمية1.
الميكوبلازما الرئوية هي واحدة من الميكوبلازما التي تصيب الإنسان ويعتقد أنها الأكثر ضراوة2. يستعمر المتفطرة الرئوية الجهاز التنفسي العلوي ، مما يؤدي إلى التهاب رئوي غير نمطي لدى الأطفال والشباب. العلامات السريرية الناتجة عن عدوى المتفطرة الرئوية تشبه الأنفلونزا ، مع الصداع والحمى والسعال3. يتم التوسط في الالتصاق الخلوي للمتفطرة الرئوية بالخلايا المضيفة بواسطة عضية مرفقة بما في ذلك الالتصاق P1 الرئيسي والعديد من البروتينات الملحقة 4,5. قد تحدث المزيد من المظاهر السريرية بسبب الالتهاب الموضعي وتحفيز الجهاز المناعي المضيف الناتج عن الالتزام الحميم للمتفطرة الرئوية بالغشاء المخاطي في مجرى الهواء6. على الرغم من أن الالتهاب الرئوي هو السمة المميزة لعدوى M. pneumoniae ، فقد تم الكشف عن أن العدوى بهذه البكتيريا يمكن أن تكون مسؤولة أيضا عن مجموعة واسعة من المظاهر غير الرئوية في مواقع تشريحية مختلفة مثل الجهاز العصبي المركزي والقلب والجلد والمفاصل7.
كما هو الحال بالنسبة لجميع أنواع الميكوبلازما ، فإن تشخيص المتفطرة الرئوية يمثل تحديا. العلامات السريرية التي تثير الميكوبلازما هي في الغالب غير واضحة وغير مميزة8. نظرا لأنه من الصعب جدا تشخيص عدوى المتفطرة الرئوية بالاعتماد فقط على المظاهر والأعراض السريرية ، فإن الفحص المختبري له أهمية خاصة9. الكشف عن مستعمرات المتفطرة الرئوية عن طريق الثقافة هو الطريقة القياسية الذهبية للتشخيص المناسب. ومع ذلك ، فإن متطلبات النمو السريعة والوقت الطويل اللازم لتقديم نتائج نهائية (1-2 أسابيع) تعقد الثقافة ، وبالتالي تعني أنها نادرا ما تستخدم للتشخيص الروتيني10. تم التحقق من صحة تقنيات تضخيم الحمض النووي من حيث السرعة والكفاءة ، على الرغم من أنها لا تعتبر اختبارات تشخيصية من الدرجة الأولى بسبب تكلفتها العالية نسبيا وعدم توفرها في بعض مرافق الرعاية الصحية. صحيح أن اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التجارية تستخدم على نطاق واسع لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية ، لكنها لا تزال غير قادرة على استبدال الأمصال. أيضا ، أدى الحدوث المتكرر لكل من النتائج السلبية والإيجابية الخاطئة إلى الحد من استخدام PCR9. وبشكل روتيني، يظل علم الأمصال هو الأكثر ممارسة في المختبرات لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية. تم الإبلاغ عن العديد من مناهج الأمصال لعقود ، مثل الهيماجلوتينين البارد ، واختبار التثبيت المتمم 11 ، واختبار التراص الدموي غير المباشر 12 ، والتألق المناعي13 ، وتقنية ELISA ، التي تم تطبيقها لأول مرة على الأمصال الميكوبلازما في أوائل عام 198014،15،16. واحدة من القضايا الرئيسية التي واجهتها عند إجراء التشخيص المصلي ELISA لعدوى المتفطرة الرئوية هي ردود الفعل المتقاطعة ، مما يقلل بشكل كبير من خصوصية التقنية. تم الإبلاغ سابقا عن امتزاز غير محدد للأمصال البشرية مع مستضدات M. pneumoniae. في الواقع ، قد لا تكون العديد من الأجسام المضادة التي اكتشفتها ELISA في الأمصال البشرية مرتبطة دائما بمستضدات الميكوبلازم 17 ، بسبب القواسم المشتركة بين M. pneumoniae مع بعض البكتيريا18,19 وبعض الأنسجة الحيوانية والبشرية20.
بسبب القراءات الخلفية العالية التي لوحظت في اختبار ELISA التقليدي الذي كان يمارس في المختبر ، كان تفسير النتائج معقدا في كثير من الأحيان ، وبالتالي كان تقديم التشخيص المناسب للمتفطرة الرئوية مهمة صعبة. أثناء مواجهة هذه المشكلة ، اخترنا تحسين M. pneumoniae ELISA عن طريق إزالة التفاعلات غير المحددة لمستضدات M. pneumoniae مع الأجسام المضادة المراد اختبارها. لهذا الغرض ، عملنا على الاستنفاد الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae غير المحددة باستخدام تقنية الامتزاز. في الواقع ، فإن الهدف الرئيسي من ELISA الذي يلتقط المستضد هو الكشف على وجه التحديد عن الغلوبولين المناعي الرئوي (Ig) G في عينات المصل البشري. يتكون مفهوم ELISA هذا بشكل أساسي من الالتقاط الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae الخاصة ، قبل إضافة عينات المصل البشري. يتم تأمين هذه الانتقائية عن طريق احتضان مستضد M. pneumoniae الخام مع مصل مضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae ، يتم إنتاجه في الأرانب في المختبر وجعله خاصا بالأنواع عن طريق الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة ، التي تنتمي أو لا تنتمي إلى فئة Mollicutes ، وتشارك المستضدات مع M . pneumoniae الأنواع و / أو المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي. تم تكرار إجراء الامتزاز ثلاث مرات ، وتم اختبار كفاءته للقضاء على التفاعل المتبادل عن طريق النشاف المناعي. مقايسة ELISA المطورة هي مزيج من الساندويتش و ELISA غير المباشر. باختصار ، يتم طلاء آبار صفيحة ELISA أولا بمصل مضاد متعدد النسيلة خاص ب M. pneumoniae. بعد ذلك ، يضاف مستضد M. pneumoniae ويحبس بين المصل المضاد والأجسام المضادة الموجودة في عينة المصل المراد اختبارها. يتم الكشف عن المركب المناعي المتشكل بواسطة جسم مضاد ثانوي مقترن بالإنزيم (IgG المترافق البيروكسيداز). يتم تصور التفاعلات عن طريق إضافة الركيزة الكروموجينية ، ويتم قياس الامتصاص طيفيا. يتم تقديم ELISA الداخلي هذا بشكل تخطيطي في الشكل 1. أثبت ELISA محلي الصنع فعاليته في الكشف عن عدوى المتفطرة الرئوية على وجه التحديد وهو حاليا أحد أكثر الاختبارات ممارسة في النشاط التشخيصي الروتيني.
تقدم هذه الورقة وصفا عاما ل ELISA الداخلي الذي تم تطويره بشكل أساسي لضمان فحص محدد ل M. pneumoniae عدوى. يتم توفير تفاصيل حول بروتوكول اختبار ELISA نفسه بالإضافة إلى بعض خطوات المعالجة السابقة واللاحقة. يتم ضمان خصوصية هذا الفحص من خلال تقنية الامتزاز. تم وصف هذا الإجراء سابقا في اختبارات ELISA الت?…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة الصحة التونسية ووزارة التعليم العالي والبحث العلمي التونسية.
4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
Bacto peptone | BD | 211677 | |
Bacto tryptone | BD | 211705 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
Thimerosal | USB | 22215 | |
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |