مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد للكشف المحدد عن الميكوبلازما الرئوية
Summary
في عدوى الميكوبلازما الرئوية ، يمكن أن تؤدي اختبارات الأمصال إلى نتائج جيدة ، ولكن مع خصوصية منخفضة بسبب التفاعل المتقاطع المناعي. يضمن ELISA الذي يلتقط المستضد الداخلي ، الموصوف في هذه الورقة ، خصوصية عالية للأنواع وقد ثبت أنه اختبار فحص موثوق به للتشخيص الدقيق للمتفطرة الرئوية.
Abstract
الميكوبلازما الرئوية هي بدائية النواة التي تعاني من نقص جدار الخلية ، والمعروفة أساسا باستعمار الجهاز التنفسي البشري وأنها مستوطنة ، مع ذروة وبائية كل 6 سنوات ، في الأطفال الأكبر سنا والشباب. يمثل تشخيص المتفطرة الرئوية تحديا بسبب الطبيعة السريعة للممرض وإمكانية النقل بدون أعراض. لا يزال التشخيص المختبري لعدوى المتفطرة الرئوية على أساس معايرة الأجسام المضادة في عينات مصل المرضى هو الطريقة الأكثر ممارسة. بسبب المشكلة المحتملة للتفاعل المناعي المتبادل مع استخدام مصل متعدد النسيلة للمتفطرة الرئوية ، تم تطوير مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد (ELISA) لتحسين خصوصية التشخيص المصلي. يتم طلاء صفائح ELISA بأجسام مضادة متعددة النسيلة M. pneumoniae ، يتم تربيتها في الأرانب وتصبح محددة بعد الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة التي تشترك في المستضدات مع أنواع M. pneumoniae و / أو من المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي . ثم يتم التعرف على المستضدات المتماثلة المتفاعلة M. pneumoniae على وجه التحديد من خلال الأجسام المضادة المقابلة لها في عينات المصل. أدى المزيد من التحسين للمعلمات الفيزيائية والكيميائية التي يتعرض لها ELISA لالتقاط المستضد إلى ELISA محدد للغاية وحساس وقابل للتكرار.
Introduction
الميكوبلازما هي من بين أصغر وأبسط بدائيات النوى المعروفة. تتميز بشكل أساسي عن البكتيريا الأخرى بعدم وجود بنية جدار الخلية. وهكذا ، تم تصنيف الميكوبلازما في فئة منفصلة تسمى Mollicutes1. يمنح نقص جدار الخلية مقاومة جوهرية لهذه الكائنات الحية الدقيقة ضد بعض العوامل المضادة للميكروبات وهو مسؤول إلى حد كبير عن تعدد أشكالها. الميكوبلازما لها جينوم صغير وحجم منخفض ، مما يحد من قدراتها الأيضية والاصطناعية الحيوية ويفسر طبيعتها الطفيلية والرمية1.
الميكوبلازما الرئوية هي واحدة من الميكوبلازما التي تصيب الإنسان ويعتقد أنها الأكثر ضراوة2. يستعمر المتفطرة الرئوية الجهاز التنفسي العلوي ، مما يؤدي إلى التهاب رئوي غير نمطي لدى الأطفال والشباب. العلامات السريرية الناتجة عن عدوى المتفطرة الرئوية تشبه الأنفلونزا ، مع الصداع والحمى والسعال3. يتم التوسط في الالتصاق الخلوي للمتفطرة الرئوية بالخلايا المضيفة بواسطة عضية مرفقة بما في ذلك الالتصاق P1 الرئيسي والعديد من البروتينات الملحقة 4,5. قد تحدث المزيد من المظاهر السريرية بسبب الالتهاب الموضعي وتحفيز الجهاز المناعي المضيف الناتج عن الالتزام الحميم للمتفطرة الرئوية بالغشاء المخاطي في مجرى الهواء6. على الرغم من أن الالتهاب الرئوي هو السمة المميزة لعدوى M. pneumoniae ، فقد تم الكشف عن أن العدوى بهذه البكتيريا يمكن أن تكون مسؤولة أيضا عن مجموعة واسعة من المظاهر غير الرئوية في مواقع تشريحية مختلفة مثل الجهاز العصبي المركزي والقلب والجلد والمفاصل7.
كما هو الحال بالنسبة لجميع أنواع الميكوبلازما ، فإن تشخيص المتفطرة الرئوية يمثل تحديا. العلامات السريرية التي تثير الميكوبلازما هي في الغالب غير واضحة وغير مميزة8. نظرا لأنه من الصعب جدا تشخيص عدوى المتفطرة الرئوية بالاعتماد فقط على المظاهر والأعراض السريرية ، فإن الفحص المختبري له أهمية خاصة9. الكشف عن مستعمرات المتفطرة الرئوية عن طريق الثقافة هو الطريقة القياسية الذهبية للتشخيص المناسب. ومع ذلك ، فإن متطلبات النمو السريعة والوقت الطويل اللازم لتقديم نتائج نهائية (1-2 أسابيع) تعقد الثقافة ، وبالتالي تعني أنها نادرا ما تستخدم للتشخيص الروتيني10. تم التحقق من صحة تقنيات تضخيم الحمض النووي من حيث السرعة والكفاءة ، على الرغم من أنها لا تعتبر اختبارات تشخيصية من الدرجة الأولى بسبب تكلفتها العالية نسبيا وعدم توفرها في بعض مرافق الرعاية الصحية. صحيح أن اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التجارية تستخدم على نطاق واسع لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية ، لكنها لا تزال غير قادرة على استبدال الأمصال. أيضا ، أدى الحدوث المتكرر لكل من النتائج السلبية والإيجابية الخاطئة إلى الحد من استخدام PCR9. وبشكل روتيني، يظل علم الأمصال هو الأكثر ممارسة في المختبرات لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية. تم الإبلاغ عن العديد من مناهج الأمصال لعقود ، مثل الهيماجلوتينين البارد ، واختبار التثبيت المتمم 11 ، واختبار التراص الدموي غير المباشر 12 ، والتألق المناعي13 ، وتقنية ELISA ، التي تم تطبيقها لأول مرة على الأمصال الميكوبلازما في أوائل عام 198014،15،16. واحدة من القضايا الرئيسية التي واجهتها عند إجراء التشخيص المصلي ELISA لعدوى المتفطرة الرئوية هي ردود الفعل المتقاطعة ، مما يقلل بشكل كبير من خصوصية التقنية. تم الإبلاغ سابقا عن امتزاز غير محدد للأمصال البشرية مع مستضدات M. pneumoniae. في الواقع ، قد لا تكون العديد من الأجسام المضادة التي اكتشفتها ELISA في الأمصال البشرية مرتبطة دائما بمستضدات الميكوبلازم 17 ، بسبب القواسم المشتركة بين M. pneumoniae مع بعض البكتيريا18,19 وبعض الأنسجة الحيوانية والبشرية20.
بسبب القراءات الخلفية العالية التي لوحظت في اختبار ELISA التقليدي الذي كان يمارس في المختبر ، كان تفسير النتائج معقدا في كثير من الأحيان ، وبالتالي كان تقديم التشخيص المناسب للمتفطرة الرئوية مهمة صعبة. أثناء مواجهة هذه المشكلة ، اخترنا تحسين M. pneumoniae ELISA عن طريق إزالة التفاعلات غير المحددة لمستضدات M. pneumoniae مع الأجسام المضادة المراد اختبارها. لهذا الغرض ، عملنا على الاستنفاد الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae غير المحددة باستخدام تقنية الامتزاز. في الواقع ، فإن الهدف الرئيسي من ELISA الذي يلتقط المستضد هو الكشف على وجه التحديد عن الغلوبولين المناعي الرئوي (Ig) G في عينات المصل البشري. يتكون مفهوم ELISA هذا بشكل أساسي من الالتقاط الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae الخاصة ، قبل إضافة عينات المصل البشري. يتم تأمين هذه الانتقائية عن طريق احتضان مستضد M. pneumoniae الخام مع مصل مضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae ، يتم إنتاجه في الأرانب في المختبر وجعله خاصا بالأنواع عن طريق الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة ، التي تنتمي أو لا تنتمي إلى فئة Mollicutes ، وتشارك المستضدات مع M . pneumoniae الأنواع و / أو المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي. تم تكرار إجراء الامتزاز ثلاث مرات ، وتم اختبار كفاءته للقضاء على التفاعل المتبادل عن طريق النشاف المناعي. مقايسة ELISA المطورة هي مزيج من الساندويتش و ELISA غير المباشر. باختصار ، يتم طلاء آبار صفيحة ELISA أولا بمصل مضاد متعدد النسيلة خاص ب M. pneumoniae. بعد ذلك ، يضاف مستضد M. pneumoniae ويحبس بين المصل المضاد والأجسام المضادة الموجودة في عينة المصل المراد اختبارها. يتم الكشف عن المركب المناعي المتشكل بواسطة جسم مضاد ثانوي مقترن بالإنزيم (IgG المترافق البيروكسيداز). يتم تصور التفاعلات عن طريق إضافة الركيزة الكروموجينية ، ويتم قياس الامتصاص طيفيا. يتم تقديم ELISA الداخلي هذا بشكل تخطيطي في الشكل 1. أثبت ELISA محلي الصنع فعاليته في الكشف عن عدوى المتفطرة الرئوية على وجه التحديد وهو حاليا أحد أكثر الاختبارات ممارسة في النشاط التشخيصي الروتيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الورقة وصفا عاما ل ELISA الداخلي الذي تم تطويره بشكل أساسي لضمان فحص محدد ل M. pneumoniae عدوى. يتم توفير تفاصيل حول بروتوكول اختبار ELISA نفسه بالإضافة إلى بعض خطوات المعالجة السابقة واللاحقة. يتم ضمان خصوصية هذا الفحص من خلال تقنية الامتزاز. تم وصف هذا الإجراء سابقا في اختبارات ELISA الت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة الصحة التونسية ووزارة التعليم العالي والبحث العلمي التونسية.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
References
- Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
- Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
- Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
- Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
- Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
- Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
- Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
- Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
- Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
- Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
- Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).
- Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
- Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
- Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
- Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
- Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
- Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
- Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
- Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
- Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
- Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
- Fawcett, P. T., O’Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
- Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
- Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).
- Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
- Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
- Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
- Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
- Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
- Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
- Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
- Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
