Antigen-capture enzym-linked immunosorbent assay til specifik påvisning af mycoplasma pneumoniae
Summary
I Mycoplasma pneumoniae infektion, serologi test kan generere gode resultater, men med lav specificitet på grund af immunologisk krydsreaktion. Den interne antigen-capture ELISA, beskrevet i dette papir, garanterer høj artsspecificitet og har vist sig at være en pålidelig screeningstest til nøjagtig diagnose af M. pneumoniae.
Abstract
Mycoplasma pneumoniae er en prokaryot med cellevægsmangel, der hovedsageligt er kendt for at kolonisere det menneskelige luftveje og være endemisk, med epidemiske toppe hvert 6. år hos ældre børn og unge voksne. Diagnose af M. pneumoniae er udfordrende på grund af patogenens kræsne natur og muligheden for asymptomatisk transport. Laboratoriediagnose af M. pneumoniae-infektion baseret på antistoftitrering i serumprøver af patienter forbliver den mest praktiserede metode. På grund af det potentielle problem med immunologisk krydsreaktivitet ved anvendelse af polyklonalt serum til M. pneumoniae er der udviklet et antigenindfangningsenzymbundet immunosorbentassay (ELISA) for at forbedre specificiteten af serologisk diagnose. ELISA-plader er belagt med M. pneumoniae polyklonale antistoffer, hævet hos kaniner og gjort specifikke efter adsorption mod et panel af heterologe bakterier, der deler antigener med M. pneumoniae-arter og / eller vides at kolonisere luftvejene. De reagerede M. pneumoniae homologe antigener genkendes derefter specifikt af deres tilsvarende antistoffer i serumprøverne. Yderligere optimering af de fysisk-kemiske parametre, som antigenindfangnings-ELISA’en udsættes for, førte til en meget specifik, følsom og reproducerbar ELISA.
Introduction
Mycoplasmer er blandt de mindste og enkleste kendte prokaryoter. De adskiller sig hovedsageligt fra andre bakterier ved manglen på en cellevægsstruktur. Således blev mycoplasmer klassificeret i en separat klasse ved navn Mollicutes1. Cellevægsmanglen giver iboende resistens over for disse mikroorganismer mod nogle antimikrobielle midler og er i høj grad ansvarlig for deres polymorfisme. Mycoplasmer har lille genom og reduceret størrelse, hvilket begrænser deres metaboliske og biosyntetiske evner og forklarer deres parasitære og saprofytiske natur1.
Mycoplasma pneumoniae er en af de Mycoplasmer, der inficerer mennesket og menes at være den mest virulente2. M. pneumoniae koloniserer de øvre luftveje, hvilket fører til atypisk lungebetændelse hos børn og unge voksne. De kliniske tegn fremkaldt af M. pneumoniae infektion er influenzalignende, med hovedpine, feber og hoste3. Cytadherensen af M. pneumoniae til værtsceller medieres af en vedhæftningsorganel, herunder P1 større adhæsion og flere tilbehørsproteiner 4,5. Flere kliniske manifestationer kan forekomme på grund af lokal inflammation og stimulering af værtsimmunsystemet som følge af den intime vedhæftning af M. pneumoniae til luftvejsslimhinden6. Selvom lungebetændelse er et kendetegn ved M. pneumoniae-infektion, er det blevet afsløret, at infektion med denne bakterie også kan være ansvarlig for et bredt spektrum af ikke-pulmonale manifestationer på forskellige anatomiske steder såsom centralnervesystemet, hjerte, hud og led7.
Som for alle Mycoplasma-arter er diagnosen M. pneumoniae udfordrende. De kliniske tegn, der fremkalder mycoplasmosis, er for det meste usynlige og ikke-karakteristiske8. Da det er meget svært at diagnosticere M. pneumoniae-infektion ved kun at stole på kliniske manifestationer og symptomer, er laboratoriescreening af særlig interesse9. Påvisning af M. pneumoniae-kolonier ved kultur er guldstandardmetoden til en korrekt diagnose. Imidlertid komplicerer de kræsne vækstkrav og den lange tid, der er nødvendig for levering af endelige resultater (1-2 uger), kulturen og betyder således, at den sjældent bruges til rutinemæssig diagnose10. Nukleinsyreamplifikationsteknologier blev valideret med hensyn til hastighed og effektivitet, selvom disse molekylære teknikker på grund af deres relativt høje omkostninger og utilgængelighed i nogle sundhedsfaciliteter ikke betragtes som diagnostiske førstelinjetest. Det er rigtigt, at kommercielle PCR-tests i vid udstrækning anvendes til at diagnosticere M. pneumoniae-infektioner, men de kan stadig ikke erstatte serologi. Også den hyppige forekomst af både falsk negative og falsk positive resultater har begrænset brugen af PCR9. Rutinemæssigt forbliver serologi den mest praktiserede i laboratorier til diagnosticering af M. pneumoniae-infektion. Flere serologiske tilgange er blevet rapporteret i årtier, såsom kolde hæmagglutininer, komplementfikseringstest11, indirekte hæmagglutinationstest 12, immunofluorescens 13 og ELISA-teknologien, som først blev anvendt til mycoplasma-serologi i begyndelsen af 1980’erne14,15,16. Et af de største problemer, der opstår ved udførelse af ELISA-serodiagnose af M. pneumoniae-infektion, er krydsreaktioner, hvilket reducerer teknikkens specificitet betydeligt. Uspecifik adsorption af humane sera med M. pneumoniae-antigener er tidligere rapporteret; Faktisk er mange af de antistoffer, der påvises af ELISA i humane sera, muligvis ikke altid bundet til mycoplasmalantigener 17 på grund af M. pneumoniaes fællestræk med nogle bakterier18,19 og nogle animalske og humane væv20.
På grund af de høje baggrundsaflæsninger, der blev observeret i den konventionelle ELISA-test, der blev praktiseret i laboratoriet, var fortolkningen af resultaterne ofte kompliceret, og derfor var leveringen af en ordentlig M. pneumoniae-diagnose en hård opgave. Mens vi stod over for dette problem, valgte vi at forbedre M. pneumoniae ELISA ved at fjerne uspecifikke reaktioner af M. pneumoniae-antigener med antistoffer, der skal testes. Til dette formål arbejdede vi på selektiv udtømning af de uspecifikke M. pneumoniae-antigener ved hjælp af adsorptionsteknikken. Faktisk er hovedmålet med antigen-capture ELISA specifikt at detektere M. pneumoniae immunoglobulin (Ig) G i humane serumprøver. Konceptet med denne ELISA består hovedsagelig af selektiv indfangning af M. pneumoniae-specifikke antigener, før de humane serumprøver tilsættes. Denne selektivitet sikres ved at inkubere M. pneumoniae råantigen med et M. pneumoniae polyklonalt antiserum, der produceres hos kaniner i laboratoriet, og gøre det artsspecifikt ved adsorption mod et panel af heterologe bakterier, der tilhører eller ikke tilhører Mollicutes-klassen, og som deler antigener med M . pneumoniae arter og / eller kendt for at kolonisere luftvejene. Adsorptionsproceduren blev gentaget tre gange, og dens effektivitet til eliminering af krydsreaktivitet blev testet ved immunoblotting. Det udviklede ELISA-assay er en kombination af sandwich og indirekte ELISA. Kort fortalt er brøndene i ELISA-pladen først belagt med et polyklonalt antiserum, der er specifikt for M. pneumoniae. Derefter tilsættes M. pneumoniae-antigen og fanges mellem antiserumet og antistofferne i serumprøven, der skal testes. Det dannede immunologiske kompleks detekteres af et sekundært enzymkonjugeret antistof (peroxidasekonjugeret IgG). Reaktionerne visualiseres ved tilsætning af kromogent substrat, og absorbansen måles spektrophotometrisk. Denne interne ELISA er skematisk præsenteret i figur 1. Den hjemmelavede ELISA viste sig at være effektiv til specifikt at detektere M. pneumoniae-infektion og er i øjeblikket en af de mest praktiserede tests i rutinemæssig diagnostisk aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette dokument indeholder en generel beskrivelse af en intern ELISA, der hovedsagelig er udviklet for at sikre specifik screening af M. pneumoniae Infektion. Detaljerne om protokollen for selve ELISA-analysen samt nogle for- og efterbehandlingstrin er angivet. Specificiteten af dette assay sikres ved adsorptionsteknikken. Denne procedure er tidligere beskrevet i ELISA-test udviklet til diagnosticering af mennesker og fugle Mycoplasmas17,24. Det …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev finansieret af det tunesiske sundhedsministerium og det tunesiske ministerium for videregående uddannelse og videnskabelig forskning.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
References
- Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
- Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
- Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
- Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
- Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
- Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
- Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
- Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
- Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
- Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
- Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).
- Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
- Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
- Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
- Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
- Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
- Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
- Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
- Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
- Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
- Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
- Fawcett, P. T., O’Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
- Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
- Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).
- Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
- Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
- Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
- Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
- Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
- Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
- Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
- Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
