DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE DE CAPTURE D’ANTIGÈNE POUR LA DÉTECTION SPÉCIFIQUE DE MYCOPLASMA PNEUMONIAE
Summary
Dans l’infection à Mycoplasma pneumoniae, les tests sérologiques peuvent générer de bons résultats, mais avec une faible spécificité en raison de la réaction immunologique croisée. Le test ELISA interne de capture d’antigènes, décrit dans cet article, garantit une spécificité élevée de l’espèce et s’est avéré être un test de dépistage fiable pour un diagnostic précis de M. pneumoniae.
Abstract
Mycoplasma pneumoniae est un procaryote déficient de la paroi cellulaire, principalement connu pour coloniser les voies respiratoires humaines et être endémique, avec des pics épidémiques tous les 6 ans, chez les enfants plus âgés et les jeunes adultes. Le diagnostic de M. pneumoniae est difficile en raison de la nature fastidieuse de l’agent pathogène et de la possibilité d’un portage asymptomatique. Le diagnostic en laboratoire de l’infection à M. pneumoniae basé sur le titrage des anticorps dans les échantillons de sérum des patients reste la méthode la plus pratiquée. En raison du problème potentiel de réactivité immunologique croisée avec l’utilisation de sérum polyclonal pour M. pneumoniae, un test immuno-enzymatique de capture d’antigènes (ELISA) a été développé pour améliorer la spécificité du diagnostic sérologique. Les plaques ELISA sont recouvertes d’anticorps polyclonaux contre M. pneumoniae, élevés chez le lapin et rendus spécifiques après adsorption contre un panel de bactéries hétérologues qui partagent des antigènes avec des espèces de M. pneumoniae et/ou sont connues pour coloniser les voies respiratoires . Les antigènes homologues de M. pneumoniae ayant réagi sont alors spécifiquement reconnus par leurs anticorps correspondants dans les échantillons de sérum. L’optimisation ultérieure des paramètres physico-chimiques auxquels l’ELISA de capture d’antigènes est soumis a conduit à un ELISA hautement spécifique, sensible et reproductible.
Introduction
Les mycoplasmes sont parmi les procaryotes connus les plus petits et les plus simples. Elles se distinguent principalement des autres bactéries par l’absence de structure de paroi cellulaire. Ainsi, les mycoplasmes ont été classés dans une classe distincte appelée Mollicutes1. La déficience de la paroi cellulaire confère une résistance intrinsèque à ces micro-organismes contre certains agents antimicrobiens et est en grande partie responsable de leur polymorphisme. Les mycoplasmes ont un génome restreint et une taille réduite, ce qui limite leurs capacités métaboliques et biosynthétiques et explique leur nature parasitaire et saprophyte1.
Mycoplasma pneumoniae est l’un des mycoplasmes qui infectent l’homme et est considéré comme le plus virulent2. M. pneumoniae colonise les voies respiratoires supérieures, entraînant une pneumonie atypique chez les enfants et les jeunes adultes. Les signes cliniques engendrés par l’infection à M. pneumoniae sont pseudo-grippaux, avec maux de tête, fièvre et toux3. La cytadhésion de M. pneumoniae aux cellules hôtes est médiée par un organite de fixation comprenant une adhérence majeure P1 et plusieurs protéines accessoires 4,5. D’autres manifestations cliniques peuvent survenir en raison d’une inflammation locale et d’une stimulation du système immunitaire de l’hôte résultant de l’adhérence intime de M. pneumoniae à la muqueuse des voies respiratoires6. Bien que la pneumonie soit une caractéristique de l’infection à M. pneumoniae, il a été révélé que l’infection par cette bactérie peut également être responsable d’un large éventail de manifestations non pulmonaires dans différents sites anatomiques tels que le système nerveux central, le cœur, la peau et les articulations7.
Comme pour toutes les espèces de Mycoplasma, le diagnostic de M. pneumoniae est difficile. Les signes cliniques évoquant la mycoplasmose sont pour la plupart inapparents et non caractéristiques8. Comme il est très difficile de diagnostiquer l’infection à M. pneumoniae en se fiant uniquement aux manifestations cliniques et aux symptômes, le dépistage en laboratoire présente un intérêt particulier9. La détection des colonies de M. pneumoniae par culture est la méthode de référence pour un diagnostic approprié. Cependant, les exigences de croissance fastidieuses et le long temps nécessaire pour obtenir des résultats définitifs (1-2 semaines) compliquent la culture, et signifie donc qu’elle est rarement utilisée pour le diagnostic de routine10. Les technologies d’amplification des acides nucléiques ont été validées en termes de rapidité et d’efficacité, bien qu’en raison de leur coût relativement élevé et de leur indisponibilité dans certains établissements de soins de santé, ces techniques moléculaires ne soient pas considérées comme des tests diagnostiques de première intention. Il est vrai que les tests PCR commerciaux sont largement utilisés pour diagnostiquer les infections à M. pneumoniae, mais ils ne peuvent toujours pas remplacer la sérologie. En outre, l’occurrence fréquente de résultats faussement négatifs et faux positifs a limité l’utilisation de la PCR9. Systématiquement, la sérologie reste la plus pratiquée dans les laboratoires pour le diagnostic de l’infection à M. pneumoniae. Plusieurs approches sérologiques ont été rapportées depuis des décennies, telles que les hémagglutinines froides, le test de fixation du complément 11, le test d’hémagglutination indirecte12, l’immunofluorescence 13 et la technologie ELISA, qui a été appliquée pour la première fois à la sérologie des mycoplasmes au début des années1980 14,15,16. L’un des principaux problèmes rencontrés lors de la réalisation du sérodiagnostic ELISA de l’infection à M. pneumoniae est les réactions croisées, ce qui réduit considérablement la spécificité de la technique. L’adsorption non spécifique de sérums humains avec des antigènes de M. pneumoniae a déjà été signalée; en fait, bon nombre des anticorps détectés par ELISA dans les sérums humains ne sont pas toujours liés aux antigènes mycoplasmiques 17, en raison de la similitude de M. pneumoniae avec certaines bactéries18,19 et certains tissus animaux et humains20.
En raison des lectures de fond élevées observées dans le test ELISA conventionnel pratiqué en laboratoire, l’interprétation des résultats était souvent compliquée et, par conséquent, la délivrance d’un diagnostic correct de M. pneumoniae était une tâche difficile. Face à ce problème, nous avons choisi d’améliorer le test ELISA de M. pneumoniae en supprimant les réactions non spécifiques des antigènes de M. pneumoniae avec des anticorps à tester. À cette fin, nous avons travaillé sur la déplétion sélective des antigènes non spécifiques de M. pneumoniae en utilisant la technique d’adsorption. En fait, l’objectif principal du test ELISA de capture d’antigènes est de détecter spécifiquement l’immunoglobuline (Ig) G de M. pneumoniae dans des échantillons de sérum humain. Le concept de ce test ELISA consiste principalement en la capture sélective d’antigènes spécifiques de M. pneumoniae, avant l’ajout des échantillons de sérum humain. Cette sélectivité est assurée par l’incubation de l’antigène brut M. pneumoniae avec un antisérum polyclonal M. pneumoniae, produit chez le lapin en laboratoire et en le rendant spécifique à l’espèce par adsorption contre un panel de bactéries hétérologues, appartenant ou non à la classe des Mollicutes, partageant des antigènes avec M. pneumoniae espèces et/ou connues pour coloniser les voies respiratoires. La procédure d’adsorption a été répétée trois fois et son efficacité à éliminer la réactivité croisée a été testée par immunobuvardage. Le test ELISA développé est une combinaison d’ELISA sandwich et indirect. Brièvement, les puits de la plaque ELISA sont d’abord recouverts d’un antisérum polyclonal spécifique à M. pneumoniae. Ensuite, l’antigène M. pneumoniae est ajouté et piégé entre l’antisérum et les anticorps présents dans l’échantillon de sérum à tester. Le complexe immunologique formé est détecté par un anticorps secondaire conjugué à l’enzyme (IgG conjuguées à la peroxydase). Les réactions sont visualisées par l’ajout de substrat chromogène et l’absorbance est mesurée par spectrophotométrique. Ce test ELISA interne est présenté schématiquement à la figure 1. Le test ELISA maison s’est avéré efficace pour détecter spécifiquement l’infection à M. pneumoniae et est actuellement l’un des tests les plus pratiqués dans l’activité diagnostique de routine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente une description générale d’un test ELISA interne principalement développé pour assurer un dépistage spécifique des M. pneumoniae Infection. Les détails sur le protocole du test ELISA lui-même ainsi que certaines étapes de pré et de post-traitement sont fournis. La spécificité de ce dosage est assurée par la technique d’adsorption. Cette procédure a déjà été décrite dans des tests ELISA développés pour le diagnostic des humains et des oiseaux. Mycoplasmas<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par le ministère tunisien de la Santé et le ministère tunisien de l’Enseignement supérieur et de la Recherche scientifique.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
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