בדיקת חיסון הקשורה לאנזים לכידת אנטיגן לזיהוי ספציפי של דלקת ריאות מיקופלסמה
Summary
בזיהום Mycoplasma pneumoniae, בדיקות סרולוגיות יכולות להניב תוצאות טובות, אך עם ספציפיות נמוכה בגלל תגובה צולבת אימונולוגית. ה- ELISA ללכידת אנטיגן פנימית, המתוארת במאמר זה, מבטיחה ספציפיות גבוהה של מינים והוכחה כבדיקת סינון אמינה לאבחון מדויק של M. pneumoniae.
Abstract
Mycoplasma pneumoniae הוא פרוקריוט חסר דופן התא, הידוע בעיקר כדי ליישב את דרכי הנשימה האנושיות להיות אנדמי, עם שיאי מגיפה כל 6 שנים, אצל ילדים גדולים יותר ומבוגרים צעירים. אבחון של M. דלקת ריאות הוא מאתגר בגלל האופי המהיר של הפתוגן ואת האפשרות של הובלה אסימפטומטית. אבחון מעבדה של זיהום M. דלקת ריאות המבוססת על טיטרציה נוגדנים בדגימות סרום של חולים נשאר השיטה המתורגלת ביותר. בגלל הבעיה הפוטנציאלית של תגובתיות צולבת אימונולוגית עם שימוש בסרום פוליקלונלי עבור M. pneumoniae, פותחה בדיקה אימונוסורבנטית הקשורה לאנזים לכידת אנטיגן (ELISA) כדי לשפר את הספציפיות של אבחון סרולוגי. לוחות ELISA מצופים בנוגדנים פוליקלונליים של M. pneumoniae, מגודלים בארנבות ומעובדים ספציפית לאחר ספיחה כנגד פאנל של חיידקים הטרולוגיים החולקים אנטיגנים עם מיני M. pneumoniae ו / או ידועים כמתיישבים בדרכי הנשימה. האנטיגנים ההומולוגיים M. pneumoniae שהגיבו מזוהים באופן ספציפי על ידי הנוגדנים המתאימים להם בדגימות הסרום. אופטימיזציה נוספת של הפרמטרים הפיסיקוכימיים שאליהם נתונה ELISA ללכידת אנטיגן הובילה ל- ELISA ספציפי מאוד, רגיש וניתן לשחזור.
Introduction
מיקופלסמות הן בין הפרוקריוטים הקטנים והפשוטים ביותר הידועים. הם נבדלים בעיקר מחיידקים אחרים על ידי היעדר מבנה דופן התא. לפיכך, מיקופלסמות סווגו בכיתה נפרדת בשם Mollicutes1. מחסור בדופן התא מקנה עמידות פנימית למיקרואורגניזמים אלה נגד כמה חומרים אנטי מיקרוביאליים והוא אחראי במידה רבה לפולימורפיזם שלהם. למיקופלסמות יש גנום קטן וגודל מוקטן, מה שמגביל את היכולות המטבוליות והביוסינטטיות שלהן ומסביר את האופי הטפילי והספרופיטי שלהן1.
מיקופלסמה דלקת ריאות היא אחת המיקופלסמות שמדביקות את האדם ונחשבת לארסיתביותר 2. M. דלקת ריאות מאכלסת את דרכי הנשימה העליונות, מה שמוביל לדלקת ריאות לא טיפוסית אצל ילדים ומבוגרים צעירים. הסימנים הקליניים הנגרמים על ידי זיהום M. דלקת ריאות הם דמויי שפעת, עם כאבי ראש, חום ושיעול3. הציטדהרנות של M. pneumoniae לתאים מארחים מתווכת על ידי אברון התקשרות הכולל הידבקות P1 מז’ורית ומספר חלבונים נלווים 4,5. ביטויים קליניים נוספים עשויים להתרחש בגלל דלקת מקומית וגירוי של המערכת החיסונית המארחת הנובעת מהיצמדות אינטימית של M. דלקת ריאות לרירית דרכי הנשימה6. למרות שדלקת ריאות היא סימן היכר של זיהום M. pneumoniae, התגלה כי זיהום עם חיידק זה יכול גם להיות אחראי על ספקטרום רחב של ביטויים לא ריאתיים באתרים אנטומיים שונים כגון מערכת העצבים המרכזית, הלב, העור, המפרקים7.
באשר לכל מיני Mycoplasma, האבחנה של M. דלקת ריאות היא מאתגרת. הסימנים הקליניים המעוררים מיקופלסמוזיס הם לרוב בלתי נראים ולא אופייניים8. מכיוון שקשה מאוד לאבחן זיהום M. דלקת ריאות על ידי הסתמכות רק על ביטויים ותסמינים קליניים, בדיקת מעבדה מעניינת במיוחד9. איתור מושבות M. דלקת ריאות לפי תרבית הוא שיטת תקן הזהב לאבחון נכון. עם זאת, דרישות הצמיחה המהירות והזמן הארוך הדרוש למתן תוצאות סופיות (1-2 שבועות) מסבכים את התרבית, ולכן פירושה שהיא משמשת לעתים נדירות לאבחון שגרתי10. טכנולוגיות הגברה של חומצות גרעין אומתו במונחים של מהירות ויעילות, אם כי בגלל העלות הגבוהה יחסית שלהן וחוסר הזמינות בחלק ממתקני הבריאות, טכניקות מולקולריות אלה אינן נחשבות לבדיקות אבחון קו ראשון. זה נכון כי בדיקות PCR מסחריות נמצאים בשימוש נרחב כדי לאבחן זיהומים M. דלקת ריאות, אבל הם עדיין לא יכולים להחליף סרולוגיה. כמו כן, המופע התכוף של תוצאות חיוביות כוזבות ותוצאות חיוביות כוזבות הגביל את השימוש ב- PCR9. באופן שגרתי, סרולוגיה נשארת המיושמת ביותר במעבדות לאבחון של זיהום M. דלקת ריאות. מספר גישות סרולוגיות דווחו במשך עשרות שנים, כגון המגלוטינינים קרים, מבחן קיבוע משלים 11, מבחן המגלוטינציה עקיף 12, אימונופלואורסצנציה13, והטכנולוגיה של ELISA, אשר יושמה לראשונה על מיקופלסמה סרולוגיה בתחילת שנות השמונים14,15,16. אחת הבעיות העיקריות נתקלו בעת ביצוע ELISA serodiagnosis של זיהום M. דלקת ריאות היא תגובות צולבות, אשר מוריד במידה ניכרת את הספציפיות של הטכניקה. ספיחה לא ספציפית של סרה אנושית עם אנטיגנים של דלקת ריאות M. דווחה בעבר; למעשה, רבים מהנוגדנים שזוהו על ידי ELISA בסרה אנושית לא תמיד קשורים לאנטיגנים מיקופלסמליים 17, בשל המשותף של M. דלקת ריאות עם כמה חיידקים18,19 וכמה רקמות בעלי חיים ובני אדם20.
בגלל קריאות הרקע הגבוהות שנצפו במבחן ELISA הקונבנציונלי שהיה נהוג במעבדה, פרשנות התוצאות הייתה לעתים קרובות מסובכת, ולכן מתן אבחנה נכונה של M. דלקת ריאות הייתה משימה קשה. בעודנו מתמודדים עם בעיה זו, בחרנו לשפר את M. pneumoniae ELISA על ידי הסרת תגובות לא ספציפיות של אנטיגנים של M. דלקת ריאות עם נוגדנים להיבדק. לשם כך, עבדנו על דלדול סלקטיבי של האנטיגנים הלא ספציפיים של M. pneumoniae באמצעות טכניקת הספיגה. למעשה, המטרה העיקרית של לכידת אנטיגן ELISA היא לזהות באופן ספציפי M. דלקת ריאות אימונוגלובולין (Ig) G בדגימות סרום אנושי. הרעיון של ELISA זה מורכב בעיקר מלכידה סלקטיבית של אנטיגנים ספציפיים לדלקת ריאות M, לפני הוספת דגימות הסרום האנושיות. סלקטיביות זו מבוטחת על ידי דגירה של אנטיגן גולמי M. pneumoniae עם אנטיסרום פוליקלונלי M. pneumoniae, המיוצר בארנבות במעבדה והפיכתו למין ספציפי על ידי ספיחה נגד פאנל של חיידקים הטרולוגיים, השייכים או לא שייכים למעמד Mollicutes, חולקים אנטיגנים עם M. pneumoniae מינים ו/או ידועים כמתיישבים בדרכי הנשימה. הליך הספיחה חזר על עצמו שלוש פעמים, ויעילותו לביטול תגובתיות צולבת נבדקה על ידי אימונובלוטציה. מבחן ELISA שפותח הוא שילוב של סנדוויץ’ ואליזה עקיפה. בקצרה, הבארות של צלחת ELISA מצופים תחילה עם אנטיסרום פוליקלונלי ספציפי M. דלקת ריאות. לאחר מכן, M. דלקת ריאות אנטיגן הוא הוסיף ולכוד בין antiserum ואת הנוגדנים הנמצאים בדגימת הסרום להיבדק. הקומפלקס האימונולוגי שנוצר מזוהה על ידי נוגדן מצומד אנזים משני (IgG מצומד פרוקסידאז). התגובות מוצגות על ידי תוספת של מצע כרומוגני, והספיגה נמדדת ספקטרופוטומטרית. ELISA פנימית זו מוצגת באופן סכמטי באיור 1. ה- ELISA הביתית הוכיחה את עצמה כיעילה באיתור ספציפי של זיהום M. pneumoniae והיא כיום אחת הבדיקות המתורגלות ביותר בפעילות אבחון שגרתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג תיאור כללי של ELISA פנימי שפותח בעיקר כדי להבטיח סינון ספציפי של M. pneumoniae זיהום. הפרטים על הפרוטוקול של מבחן ELISA עצמו, כמו גם כמה שלבים לפני ואחרי העיבוד מסופקים. הספציפיות של בדיקה זו מובטחת על ידי טכניקת ספיחה. הליך זה תואר בעבר בבדיקות ELISA שפותחו לאבחון בני אדם ועופות Mycoplasm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר מומן על ידי משרד הבריאות התוניסאי והמשרד התוניסאי להשכלה גבוהה ולמחקר מדעי.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
References
- Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
- Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
- Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
- Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
- Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
- Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
- Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
- Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
- Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
- Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
- Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).
- Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
- Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
- Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
- Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
- Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
- Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
- Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
- Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
- Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
- Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
- Fawcett, P. T., O’Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
- Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
- Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).
- Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
- Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
- Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
- Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
- Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
- Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
- Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
- Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
