Saggio immunoassorbente legato all'enzima di cattura dell'antigene per la rilevazione specifica di Mycoplasma pneumoniae
Summary
Nell’infezione da Mycoplasma pneumoniae, i test sierologici possono generare buoni risultati, ma con bassa specificità a causa della reazione crociata immunologica. L’ELISA interno per la cattura dell’antigene, descritto in questo articolo, garantisce un’elevata specificità delle specie e ha dimostrato di essere un test di screening affidabile per una diagnosi accurata di M. pneumoniae.
Abstract
Il Mycoplasma pneumoniae è un procariota carente della parete cellulare, noto principalmente per colonizzare il tratto respiratorio umano e per essere endemico, con picchi epidemici ogni 6 anni, nei bambini più grandi e nei giovani adulti. La diagnosi di M. pneumoniae è difficile a causa della natura meticolosa dell’agente patogeno e della possibilità di trasporto asintomatico. La diagnosi di laboratorio dell’infezione da M. pneumoniae basata sulla titolazione degli anticorpi nei campioni di siero dei pazienti rimane il metodo più praticato. A causa del potenziale problema della cross-reattività immunologica con l’uso di siero policlonale per M. pneumoniae, è stato sviluppato un saggio di immunoassorbimento enzimatico legato all’antigene (ELISA) per migliorare la specificità della diagnosi sierologica. Le piastre ELISA sono rivestite con anticorpi policlonali M. pneumoniae, allevati nei conigli e resi specifici dopo l’adsorbimento contro un pannello di batteri eterologhi che condividono antigeni con le specie di M. pneumoniae e/o sono noti per colonizzare le vie respiratorie . Gli antigeni omologhi di M. pneumoniae reagiti vengono quindi specificamente riconosciuti dai loro anticorpi corrispondenti nei campioni di siero. Un’ulteriore ottimizzazione dei parametri fisico-chimici a cui è sottoposto l’ELISA di cattura dell’antigene ha portato a un ELISA altamente specifico, sensibile e riproducibile.
Introduction
I micoplasmi sono tra i procarioti più piccoli e semplici conosciuti. Si distinguono principalmente dagli altri batteri per la mancanza di una struttura della parete cellulare. Pertanto, i micoplasmi sono stati classificati in una classe separata denominata Mollicutes1. Il deficit della parete cellulare conferisce resistenza intrinseca a questi microrganismi contro alcuni agenti antimicrobici ed è in gran parte responsabile del loro polimorfismo. I micoplasmi hanno un genoma piccolo e dimensioni ridotte, il che limita le loro capacità metaboliche e biosintetiche e spiega la loro natura parassitaria e saprofita1.
Mycoplasma pneumoniae è uno dei micoplasmi che infettano l’uomo e si pensa che sia il più virulento2. M. pneumoniae colonizza il tratto respiratorio superiore, portando a polmonite atipica nei bambini e nei giovani adulti. I segni clinici generati dall’infezione da M. pneumoniae sono simil-influenzali, con mal di testa, febbre e tosse3. La cytadherence di M. pneumoniae alle cellule ospiti è mediata da un organello di attaccamento che include l’adesione maggiore P1 e diverse proteine accessorie 4,5. Altre manifestazioni cliniche possono verificarsi a causa dell’infiammazione locale e della stimolazione del sistema immunitario dell’ospite derivanti dall’aderenza intima di M. pneumoniae alla mucosa delle vie aeree6. Sebbene la polmonite sia un segno distintivo dell’infezione da M. pneumoniae, è stato rivelato che l’infezione da questo batterio può anche essere responsabile di un ampio spettro di manifestazioni non polmonari in diversi siti anatomici come il sistema nervoso centrale, il cuore, la pelle e le articolazioni7.
Come per tutte le specie di Mycoplasma, la diagnosi di M. pneumoniae è impegnativa. I segni clinici che evocano la micoplasmosi sono per lo più inapparenti e non caratteristici8. Poiché è molto difficile diagnosticare l’infezione da M. pneumoniae basandosi solo su manifestazioni e sintomi clinici, lo screening di laboratorio è di particolare interesse9. Rilevare le colonie di M. pneumoniae mediante coltura è il metodo gold standard per una corretta diagnosi. Tuttavia, i meticolosi requisiti di crescita e il lungo tempo necessario per la consegna dei risultati definitivi (1-2 settimane) complicano la coltura, e quindi significa che viene raramente utilizzata per la diagnosi di routine10. Le tecnologie di amplificazione degli acidi nucleici sono state convalidate in termini di velocità ed efficienza, anche se a causa del loro costo relativamente elevato e dell’indisponibilità in alcune strutture sanitarie, queste tecniche molecolari non sono considerate test diagnostici di prima linea. È vero che i test PCR commerciali sono ampiamente utilizzati per diagnosticare le infezioni da M. pneumoniae, ma non possono ancora sostituire la sierologia. Inoltre, il frequente verificarsi di risultati falsi negativi e falsi positivi ha limitato l’uso della PCR9. Di routine, la sierologia rimane la più praticata nei laboratori per la diagnosi dell’infezione da M. pneumoniae. Diversi approcci sierologici sono stati riportati per decenni, come le emoagglutinine fredde, il test di fissazione del complemento11, il test di emoagglutinazione indiretta 12, l’immunofluorescenza 13 e la tecnologia di ELISA, che è stata applicata per la prima volta alla sierologia del micoplasma nei primi anni 198014,15,16. Uno dei principali problemi riscontrati durante l’esecuzione della sierodiagnosi ELISA dell’infezione da M. pneumoniae sono le reazioni crociate, che riducono considerevolmente la specificità della tecnica. In precedenza è stato riportato adsorbimento aspecifico di sieri umani con antigeni di M. pneumoniae; infatti, molti degli anticorpi rilevati dall’ELISA nei sieri umani potrebbero non essere sempre legati agli antigeni micoplasmatici 17, a causa della comunanza di M. pneumoniae con alcuni batteri18,19 e alcuni tessuti animali e umani20.
A causa delle elevate letture di fondo osservate nel test ELISA convenzionale praticato in laboratorio, l’interpretazione dei risultati era spesso complicata e quindi la consegna di una corretta diagnosi di M. pneumoniae era un compito difficile. Di fronte a questo problema, abbiamo optato per migliorare l’ELISA di M. pneumoniae rimuovendo le reazioni non specifiche degli antigeni di M. pneumoniae con anticorpi da testare. A questo scopo, abbiamo lavorato sulla deplezione selettiva degli antigeni non specifici di M. pneumoniae utilizzando la tecnica dell’adsorbimento. Infatti, l’obiettivo principale dell’ELISA di cattura dell’antigene è quello di rilevare specificamente l’immunoglobulina (Ig) G di M. pneumoniae nei campioni di siero umano. Il concetto di questo ELISA consiste principalmente nella cattura selettiva di antigeni specifici di M. pneumoniae, prima di aggiungere i campioni di siero umano. Questa selettività è assicurata mediante l’incubazione dell’antigene grezzo di M. pneumoniae con un antisiero policlonale M. pneumoniae, prodotto nei conigli in laboratorio e rendendolo specie-specifico mediante adsorbimento contro un pannello di batteri eterologhi, appartenenti o non appartenenti alla classe Mollicutes, che condividono antigeni con M. pneumoniae specie e/o note per colonizzare le vie respiratorie. La procedura di adsorbimento è stata ripetuta tre volte e la sua efficacia nell’eliminare la cross-reattività è stata testata mediante immunoblotting. Il test ELISA sviluppato è una combinazione di ELISA a sandwich e ELISA indiretto. In breve, i pozzetti della piastra ELISA vengono prima rivestiti con un antisiero policlonale specifico per M. pneumoniae. Quindi, l’antigene di M. pneumoniae viene aggiunto e intrappolato tra l’antisiero e gli anticorpi presenti nel campione di siero da testare. Il complesso immunologico formato viene rilevato da un anticorpo secondario coniugato enzimatico (IgG coniugate con perossidasi). Le reazioni vengono visualizzate mediante l’aggiunta di substrato cromogenico e l’assorbanza viene misurata spettrofotometricamente. Questo ELISA interno è schematicamente presentato nella Figura 1. L’ELISA fatto in casa si è dimostrato efficace nel rilevare specificamente l’infezione da M. pneumoniae ed è attualmente uno dei test più praticati nell’attività diagnostica di routine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento presenta una descrizione generale di un ELISA interno sviluppato principalmente per garantire uno screening specifico di M. pneumoniae Infezione. Vengono forniti i dettagli sul protocollo del test ELISA stesso e alcune fasi di pre e post-elaborazione. La specificità di questo test è assicurata dalla tecnica di adsorbimento. Questa procedura è stata precedentemente descritta nei test ELISA sviluppati per la diagnosi di esseri umani e aviari Mycoplasmas17,<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dal Ministero della Salute tunisino e dal Ministero tunisino dell’Istruzione Superiore e della Ricerca Scientifica.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
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