DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE DE CAPTURE D’ANTIGÈNE POUR LA DÉTECTION SPÉCIFIQUE DE MYCOPLASMA PNEUMONIAE

Résumé

Dans l’infection à Mycoplasma pneumoniae, les tests sérologiques peuvent générer de bons résultats, mais avec une faible spécificité en raison de la réaction immunologique croisée. Le test ELISA interne de capture d’antigènes, décrit dans cet article, garantit une spécificité élevée de l’espèce et s’est avéré être un test de dépistage fiable pour un diagnostic précis de M. pneumoniae.

Résumé

Mycoplasma pneumoniae est un procaryote déficient de la paroi cellulaire, principalement connu pour coloniser les voies respiratoires humaines et être endémique, avec des pics épidémiques tous les 6 ans, chez les enfants plus âgés et les jeunes adultes. Le diagnostic de M. pneumoniae est difficile en raison de la nature fastidieuse de l’agent pathogène et de la possibilité d’un portage asymptomatique. Le diagnostic en laboratoire de l’infection à M. pneumoniae basé sur le titrage des anticorps dans les échantillons de sérum des patients reste la méthode la plus pratiquée. En raison du problème potentiel de réactivité immunologique croisée avec l’utilisation de sérum polyclonal pour M. pneumoniae, un test immuno-enzymatique de capture d’antigènes (ELISA) a été développé pour améliorer la spécificité du diagnostic sérologique. Les plaques ELISA sont recouvertes d’anticorps polyclonaux contre M. pneumoniae, élevés chez le lapin et rendus spécifiques après adsorption contre un panel de bactéries hétérologues qui partagent des antigènes avec des espèces de M. pneumoniae et/ou sont connues pour coloniser les voies respiratoires . Les antigènes homologues de M. pneumoniae ayant réagi sont alors spécifiquement reconnus par leurs anticorps correspondants dans les échantillons de sérum. L’optimisation ultérieure des paramètres physico-chimiques auxquels l’ELISA de capture d’antigènes est soumis a conduit à un ELISA hautement spécifique, sensible et reproductible.

Introduction

Les mycoplasmes sont parmi les procaryotes connus les plus petits et les plus simples. Elles se distinguent principalement des autres bactéries par l’absence de structure de paroi cellulaire. Ainsi, les mycoplasmes ont été classés dans une classe distincte appelée Mollicutes¹. La déficience de la paroi cellulaire confère une résistance intrinsèque à ces micro-organismes contre certains agents antimicrobiens et est en grande partie responsable de leur polymorphisme. Les mycoplasmes ont un génome restreint et une taille réduite, ce qui limite leurs capacités métaboliques et biosynthétiques et explique leur nature parasi....

Protocole

La présente étude a été menée conformément aux aspects éthiques établis par le comité d’éthique de l’Institut Pasteur de Tunis.

1. Étapes pré-ELISA : Prérequis et prétraitement

1. Souches bactériennes et milieux de croissance
   REMARQUE : Les espèces de mollicutes et les bactéries à paroi utilisées dans la présente étude ainsi que leurs milieux de croissance sont énumérés dans le tableau 1.
   1. Croissance des espèces de Mollicutes
      1. Inoculer 200 μL du stock de glycérol de chaque espèce dans 1 800 μL du milieu.
      2. Cultiver les espèces de Mollicutes statiquement à 37 °C avec 5% de CO ....

Résultats

L’activité immunoblotting de l’antisérum polyclonal non adsorbé Mycoplasma pneumoniae contre les bactéries hétérologues
La réactivité croisée existe bel et bien comme le montrent les résultats de l’immunoblot (Figure 2) et par rapport au témoin positif (Lane 1), certains des antigènes de M. pneumoniae sont partagés avec les bactéries dépistées. L’intensité de ces réactions croisées était variable. Par exemple, les antigè.......

Discussion

Cet article présente une description générale d’un test ELISA interne principalement développé pour assurer un dépistage spécifique des M. pneumoniae Infection. Les détails sur le protocole du test ELISA lui-même ainsi que certaines étapes de pré et de post-traitement sont fournis. La spécificité de ce dosage est assurée par la technique d’adsorption. Cette procédure a déjà été décrite dans des tests ELISA développés pour le diagnostic des humains et des oiseaux. Mycoplasmas¹⁷

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4-chloro-1-naphtol	Sigma-Aldrich	C6788-50 TAB
Bacto peptone	BD	211677
Bacto tryptone	BD	211705
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A9647-50 G
Tampon de bicarbonate	Sigma-Aldrich	C3041-50 Cap
Caséine	Sigma-Aldrich	C7078-1 KG
CMRL1066  ;	VWR	P0058-N1L
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528-1KG
Difco PPLO Bouillon	BD	255420	Frey media
ELISA plate-Reader	MULTISKAN GO, Thermo Scientific	Ref : 51119200
Sérum bovin fœtal	Capricorn Scientific	FBS-12A
Goat peroxidase-conjugué anti-human	IgG Abcam	ab6759
IgG de chèvre conjuguée à la peroxydase IgG	Life Technologies	656120
Acide chlorhydrique 37 %	Prolab	2025.290
Peroxyde d’hydrogène (H2O2), solution 30 %	Scharlau	HI01361000
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006-1KG
LB bouillon	Préparé à l’Institut Pasteur de Tunis		Fourni par le laboratoire de bactériologie de l’Institut Pasteur de Tunis
Mycoplasma pneumoniae antisérum polyclonal produit chez le lapin	Produit à l’Institut Pasteur de Tunis		sérum a été produit par immunisation de lapin à l’Institut Pasteur de Tunis
Nicotinamide adénine dinucléotide	Sigma-Aldrich	N7004-10G
Nunc Maxisorp plaque de microtitration à fond plat à 96 puits  ;	Invitrogen	44-2404-21
Pénicilline G sodique (1 MIU)	PANPHARMA
Phénol rouge	fluka chemika	77660
Lait écrémé	MP Biomedicals	902887
Bicarbonate de sodium  ;	Sigma-Aldrich	S6297-1KG
Carbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S7795-1KG
Chlorure de sodium (NaCl)	Novachim	PS02805
Acide sulfurique (H2SO<>4) 95-97 %	Merck	1007311011
Thimerosal	USB	22215
Substrat TMB (3,3', 5,5' Solution de tétraméthylbenzidine)	Abcam	ab142042
Base Trizma	Sigma-Aldrich	T6791-1 KG
Tween 20	Sigma-Aldrich	1379-500 ML
Extrait de levure, poudre, Ultrapur	Thermo Scientific  ;	J23547  ;

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