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Biologie

マイコプラズマ・ニューモニエの特異的検出のための抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ(英語)

Published: February 24, 2023
doi:
10.3791/64645
, , , ,
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development,Pasteur Institute of Tunis

Summary

マイコプラズマ・ニューモニエ感染症では、血清学的検査は良好な結果を生み出すことができますが、免疫学的交差反応のために特異性は低くなります。この論文に記載されている社内抗原捕捉ELISAは、高い種特異性を保証し、肺炎球菌の正確な診断のための信頼できるスクリーニング検査であることが示されています。

Abstract

マイコプラズマ・ニューモニエ は細胞壁欠損原核生物であり、主にヒトの気道にコロニーを形成し、流行していることが知られており、年長の子供や若年成人では6年ごとに流行のピークがあります。 M.肺炎 の診断は、病原体の潔癖な性質と無症候性の運搬の可能性があるため、困難です。患者の血清サンプル中の抗体滴定に基づく 肺炎 菌感染症の臨床検査は、依然として最も実践されている方法である。 M. pneumoniaeに対するポリクローナル血清の使用による免疫学的交差反応性の潜在的な問題のために、血清学的診断の特異性を改善するために抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が開発されました。ELISAプレートは、 M. pneumoniae ポリクローナル抗体でコーティングされ、ウサギで飼育され、 M. pneumoniae 種と抗原を共有する、および/または気道にコロニーを形成することが知られている異種細菌のパネルに対する吸着後に特異的になります。反応した M. pneumoniae 相同抗原は、次いで、血清サンプル中のそれらの対応する抗体によって特異的に認識される。抗原捕捉ELISAが受ける物理化学的パラメータのさらなる最適化は、非常に特異的で、感度が高く、再現性の高いELISAにつながりました。

Introduction

マイコプラズマは 、最も小さく、最も単純な既知の原核生物の一つです。それらは主に細胞壁構造の欠如によって他の細菌と区別される。したがって、 マイコプラズマは モリキューテス1という名前の別のクラスに分類されました。細胞壁欠損症は、いくつかの抗菌剤に対してこれらの微生物に対する固有の耐性を与え、それらの多型の主な原因です。 マイコプラズマは ゲノムが小さく、サイズが小さく、代謝および生合成能力が制限され、寄生および腐生の性質を説明しています1。

マイコプラズマ・ニューモニエは、人間に感染するマイコプラズマの1つであり、最も毒性が高いと考えられています2。M.肺炎は上気道にコロニーを形成し、小児および若年成人に非定型肺炎を引き起こします。肺炎球菌感染によって引き起こされる臨床徴候はインフルエンザのようなもので、頭痛、発熱、咳3があります。宿主細胞に対するM. pneumoniaeの細胞付着は、P1主要な接着およびいくつかの付属品タンパク質を含む付着オルガネラによって媒介される4,5。気道粘膜へのM.肺炎の密接な付着に起因する局所的な炎症および宿主免疫系の刺激のために、より多くの臨床症状が発生する可能性があります6。肺炎は肺炎菌感染の特徴ですが、この細菌による感染は、中枢神経系、心臓、皮膚、関節などのさまざまな解剖学的部位における広範囲の非肺症状の原因にもなる可能性があることが明らかになっています7。

すべてのマイコプラズマ種に関して、M.肺炎の診断は困難です。マイコプラズマ症を誘発する臨床徴候はほとんど不明であり、特徴的ではありません8。肺炎球菌感染症を臨床症状と症状のみに頼って診断することは非常に難しいため、臨床検査は特に興味深いものです9。培養によるM.肺炎コロニーの検出は、適切な診断のためのゴールドスタンダードの方法です。しかし、慎重な成長要件と決定的な結果の提供に必要な長い時間(1〜2週間)は培養を複雑にし、したがってそれが日常的な診断に使用されることはめったにないことを意味します10。核酸増幅技術は速度と効率の点で検証されましたが、コストが比較的高く、一部の医療施設では利用できないため、これらの分子技術は第一選択の診断テストとは見なされません。市販のPCR検査が肺炎球菌感染症の診断に広く使用されているのは事実ですが、それでも血清学に取って代わることはできません。また、偽陰性と偽陽性の両方の結果が頻繁に発生するため、PCR9の使用が制限されています。日常的に、血清学は、肺炎球菌感染症の診断のために実験室で最も実践されています。冷赤血球凝集素、補体結合試験11、間接赤血球凝集試験12、免疫蛍光13、および1980年代初頭にマイコプラズマ血清学に最初に適用されたELISAの技術など、いくつかの血清学的アプローチが数十年にわたって報告されています14,15,16。肺炎球菌感染症のELISA血清診断を行う際に遭遇する主要な問題の1つは交差反応であり、これは技術の特異性をかなり低下させる。M.肺炎抗原によるヒト血清の非特異的吸着は以前に報告されています。実際、ヒト血清中のELISAによって検出された抗体の多くは、一部の細菌18,19および一部の動物およびヒト組織とのM.肺炎の共通性のために、マイコプラズマ抗原17に常に結合しているとは限りません20。

実験室で実施された従来のELISA検査で観察された高いバックグラウンド測定値のために、結果の解釈はしばしば複雑であり、したがって適切な肺炎球菌診断の提供は困難な課題でした。この問題に直面しながら、我々は、M. pneumoniae抗原と試験する抗体との非特異的反応を除去することにより、M. pneumoniae ELISAを改善することを選択しました。この目的のために、吸着技術を用いて非特異的肺炎球菌抗原の選択的枯渇に取り組みました。実際、抗原捕捉ELISAの主な目的は、ヒト血清サンプル中の肺炎球菌免疫グロブリン(Ig)Gを特異的に検出することです。このELISAの概念は、主にヒト血清サンプルを追加する前に、肺炎球菌特異的抗原を選択的に捕捉することで構成されています。この選択性は、実験室でウサギで産生されたM.肺炎粗抗原をM.肺炎ポリクローナル抗血清とインキュベートし、モリキューテスクラスに属するかどうかにかかわらず、M.肺炎と抗原を共有する異種細菌のパネルに対する吸着によって種特異的にすることによって保証されます。 種および/または気道にコロニーを形成することが知られている。吸着手順を3回繰り返し、交差反応性を排除する効率をイムノブロッティングで試験した。開発されたELISAアッセイは、サンドイッチELISAと間接ELISAの組み合わせです。簡単に説明すると、ELISAプレートのウェルは、最初にM.ニューモニエに特異的なポリクローナル抗血清でコーティングされる。次いで、M. pneumoniae抗原が添加され、抗血清と試験対象の血清サンプル中に存在する抗体との間に捕捉される。形成された免疫学的複合体は、二次酵素結合抗体(ペルオキシダーゼ結合IgG)によって検出される。反応は発色基質の添加によって視覚化され、吸光度は分光光度法で測定されます。この社内ELISAを図1に模式的に示します。自家製のELISAは、肺炎球菌感染を特異的に検出するのに効率的であることが証明され、現在、日常的な診断活動で最も実践されている検査の1つです。

Protocol

本研究は、チュニスパスツール研究所の倫理委員会によって確立された倫理的側面に準拠して実施された。 1. ELISA前のステップ:前提条件と前処理 細菌株および増殖培地注:本研究で使用されたモリキューテス種と壁に囲まれた細菌、およびそれらの増殖培地を 表1に示します。モリキューテス種の成長各種のグリセロールス…

Representative Results

異種細菌に対する非吸着ポリクローナルマイコプラズマ・ニューモニエ抗血清のイムノブロッティング活性イムノブロッティングの結果(図2)で示されているように交差反応性は実際に存在し、ポジティブコントロール(レーン1)と比較して、肺炎球菌抗原の一部はスクリーニングされた細菌と共有されています。こ?…

Discussion

この論文では、主に特定のスクリーニングを確実にするために開発された社内ELISAの一般的な説明を示します。 M. pneumoniae 感染症。ELISAアッセイ自体のプロトコルに関する詳細、およびいくつかの前処理および後処理ステップが提供されます。このアッセイの特異性は、吸着技術によって保証されます。この手順は、ヒトおよび鳥類の診断用に開発されたELISA試験で以前に説明されてい?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、チュニジア保健省とチュニジア高等教育科学研究省から資金提供を受けました。

Materials

4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 
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Citer Cet Article
Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).
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