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Biologie

마이코플라스마 폐렴의 특이적 검출을 위한 항원-포획 효소 결합 면역흡착 분석

Published: February 24, 2023
doi:
10.3791/64645
, , , ,
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development,Pasteur Institute of Tunis

Summary

마이코플라스마 폐렴 감염에서 혈청 검사는 좋은 결과를 생성할 수 있지만 면역학적 교차 반응으로 인해 특이도가 낮습니다. 이 논문에 설명된 사내 항원 포획 ELISA는 높은 종 특이성을 보장하며 M. pneumoniae의 정확한 진단을 위한 신뢰할 수 있는 선별 검사로 나타났습니다.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae 는 세포벽 결핍 원핵생물로, 주로 인간의 호흡기를 식민지화하고 풍토병으로 알려져 있으며 6년마다 전염병이 최고조에 달하는 것으로 알려져 있습니다. M. pneumoniae 의 진단은 병원균의 까다로운 특성과 무증상 운송의 가능성 때문에 어렵습니다. 환자의 혈청 샘플에서 항체 적정에 기초한 M. pneumoniae 감염의 실험실 진단은 가장 많이 시행되는 방법으로 남아 있습니다. M. pneumoniae에 대한 다클론 혈청의 사용으로 인한 면역 학적 교차 반응의 잠재적 인 문제 때문에 혈청 학적 진단의 특이성을 향상시키기 위해 항원 포획 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)이 개발되었습니다. ELISA 플레이트는 M. pneumoniae polyclonal 항체로 코팅되고, 토끼에서 자라며, M. pneumoniae 종과 항원을 공유하거나 호흡기를 식민지화하는 것으로 알려진 이종 박테리아 패널에 대해 흡착 후 특이적으로 렌더링됩니다 . 반응된 M. pneumoniae 상동 항원은 혈청 샘플에서 그의 상응하는 항체에 의해 특이적으로 인식된다. 항원-포획 ELISA가 적용되는 물리화학적 파라미터의 추가 최적화는 매우 특이적이고 민감하며 재현 가능한 ELISA를 유도했습니다.

Introduction

마이코플라스마 는 알려진 가장 작고 단순한 원핵생물 중 하나입니다. 그들은 주로 세포벽 구조가 없기 때문에 다른 박테리아와 구별됩니다. 따라서 마이코 플라스마는 Mollicutes1이라는 별도의 클래스로 분류되었습니다. 세포벽 결핍은 일부 항균제에 대해 이러한 미생물에 대한 내재적 내성을 부여하며 다형성에 크게 책임이 있습니다. 마이코플라스마는 게놈이 작고 크기가 작아 대사 및 생합성 능력을 제한하고 기생 및 부생균 특성을 설명합니다1.

마이코플라스마 폐렴은 사람을 감염시키는 마이코플라스마 중 하나이며 가장 독성이 강한 것으로 생각됩니다2. M. pneumoniae는 상부 호흡기를 식민지화하여 어린이와 젊은 성인의 비정형 성 폐렴을 유발합니다. M. pneumoniae 감염으로 인한 임상 징후는 두통, 발열 및 기침과 함께 독감과 유사합니다3. 숙주 세포에 대한 M. pneumoniae의 세포 부착은 P1 주요 접착 및 여러 보조 단백질 4,5를 포함하는 부착 소기관에 의해 매개됩니다. 기도 점막에 대한 M. pneumoniae의 친밀한 부착으로 인한 숙주 면역계의 국소 염증 및 자극으로 인해 더 많은 임상 증상이 발생할 수 있습니다6. 폐렴은 M. pneumoniae 감염의 특징이지만,이 박테리아에 의한 감염은 또한 중추 신경계, 심장, 피부 및 관절과 같은 다양한 해부학 적 부위에서 광범위한 비 폐 증상을 유발할 수 있음이 밝혀졌습니다7.

모든 마이코플라스마 종에 관해서는 M. pneumoniae의 진단이 어렵습니다. 마이코 플라스마 증을 유발하는 임상 징후는 대부분 명백하지 않고 특징이 없습니다8. 임상 증상과 증상에만 의존하여 M. pneumoniae 감염을 진단하는 것은 매우 어렵 기 때문에 실험실 스크리닝이 특히 중요합니다9. 배양으로 M. pneumoniae 콜로니를 검출하는 것은 적절한 진단을위한 황금 표준 방법입니다. 그러나 까다로운 성장 요구 사항과 최종 결과 (1-2 주)를 제공하는 데 필요한 긴 시간은 문화를 복잡하게 만들어 일상적인 진단에 거의 사용되지 않음을 의미합니다10. 핵산 증폭 기술은 속도와 효율성 측면에서 검증되었지만 상대적으로 높은 비용과 일부 의료 시설에서 사용할 수 없기 때문에 이러한 분자 기술은 1 차 진단 테스트로 간주되지 않습니다. 상용 PCR 검사가 M. pneumoniae 감염을 진단하는 데 널리 사용되는 것은 사실이지만 여전히 혈청학을 대체 할 수는 없습니다. 또한 위음성 및 위양성 결과가 모두 자주 발생하여 PCR9의 사용이 제한되었습니다. 일상적으로, 혈청학은 M. pneumoniae 감염의 진단을 위해 실험실에서 가장 많이 시행되고 있습니다. 차가운 혈구 응집소, 보체 고정 검사 11, 간접 혈구 응집 검사 12, 면역 형광검사 13 및 1980 년대 초 마이코 플라스마 혈청학에 처음 적용된 ELISA 기술과 같은 여러 혈청 학적 접근법이 수십 년 동안보고되었습니다14,15,16. M. pneumoniae 감염의 ELISA 혈청 진단을 수행 할 때 발생하는 주요 문제 중 하나는 교차 반응이며, 이는 기술의 특이성을 상당히 낮 춥니 다. M. pneumoniae 항원을 사용한 인간 혈청의 비특이적 흡착은 이전에 보고되었습니다. 사실, 인간 혈청에서 ELISA에 의해 검출된 많은 항체는 일부 박테리아(18,19) 및 일부 동물 및 인간 조직(20)과의 M. pneumoniae의 공통성으로 인해 마이코플라스마 항원(17)에 항상 결합되지 않을 수 있다.

실험실에서 시행 된 기존의 ELISA 검사에서 관찰 된 높은 배경 판독 값으로 인해 결과 해석이 종종 복잡했기 때문에 적절한 M. pneumoniae 진단을 전달하는 것은 어려운 과제였습니다. 이 문제에 직면하는 동안 우리는 테스트 할 항체와 M. pneumoniae 항원의 비특이적 반응을 제거하여 M. pneumoniae ELISA를 개선하기로 결정했습니다. 이를 위해 흡착 기술을 사용하여 비특이적 M. pneumoniae 항원의 선택적 고갈에 대해 연구했습니다. 사실, 항원 포획 ELISA의 주요 목표는 인간 혈청 샘플에서 M. pneumoniae 면역 글로불린 (Ig) G를 특이 적으로 검출하는 것입니다. 이 ELISA의 개념은 주로 인간 혈청 샘플을 추가하기 전에 M. pneumoniae 특이 항원의 선택적 포획으로 구성됩니다. 이 선택성은 실험실에서 토끼에서 생산되는 M. pneumoniae polyclonal antiserum과 함께 M. pneumoniae 원유 항원을 배양하고 Mollicutes 클래스에 속하거나 속하지 않는 이종 박테리아 패널에 대한 흡착에 의해 종 특이 적으로 만들어 M. pneumoniae 와 항원을 공유함으로써 보장됩니다. 종 및/또는 호흡기를 식민지화하는 것으로 알려져 있습니다. 흡착 절차를 세 번 반복하고, 교차 반응을 제거하는 그의 효율을 면역 블로팅에 의해 시험하였다. 개발된 ELISA 분석은 샌드위치와 간접 ELISA의 조합입니다. 간단히 말해서, ELISA 플레이트의 웰은 먼저 M. pneumoniae에 특이적인 다클론 항혈청으로 코팅됩니다. 이어서, M. pneumoniae 항원을 첨가하고, 항혈청과 시험될 혈청 샘플에 존재하는 항체 사이에 포획한다. 형성된 면역 복합체는 2 차 효소 – 접합 된 항체 (퍼 옥시다제 – 접합 된 IgG)에 의해 검출된다. 반응은 발색 기질의 첨가에 의해 시각화되고, 흡광도는 분광 광도계로 측정된다. 이 사내 ELISA는 그림 1에 개략적으로 나와 있습니다. 수제 ELISA는 M. pneumoniae 감염을 특이적으로 감지하는 데 효율적인 것으로 입증되었으며 현재 일상적인 진단 활동에서 가장 많이 시행되는 테스트 중 하나입니다.

Protocol

본 연구는 튀니스 파스퇴르 연구소의 윤리위원회가 설립 한 윤리적 측면에 따라 수행되었습니다. 1. 사전 ELISA 단계: 전제 조건 및 전처리 박테리아 균주 및 성장 배지참고: 본 연구에 사용된 Mollicutes 종과 벽으로 둘러싸인 박테리아 및 성장 배지는 표 1에 나열되어 있습니다.연체 동물의 성장각 종의 글리세롤 스톡으로부터 200 μL…

Representative Results

이종 박테리아에 대한 흡착되지 않은 다클론 마이코플라스마 폐렴 항혈청의 면역블로팅 활성교차 반응은 면역블로팅 결과(그림 2)에서 입증된 바와 같이 실제로 존재하며 양성 대조군(레인 1)과 비교하여 일부 M. pneumoniae 항원은 선별된 박테리아와 공유됩니다. 이러한 교차 반응의 강도는 다양했습니다. 예를 들어, M. …

Discussion

이 백서는 주로 특정 스크리닝을 보장하기 위해 개발된 사내 ELISA에 대한 일반적인 설명을 제공합니다. M. pneumoniae 감염. ELISA 분석 자체의 프로토콜과 일부 전처리 및 후처리 단계에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 이 분석의 특이성은 흡착 기술에 의해 보장됩니다. 이 절차는 이전에 인간 및 조류 진단을 위해 개발 된 ELISA 검사에서 설명되었습니다. Mycoplasmas17,</sup…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 튀니지 보건부와 튀니지 고등 교육 및 과학 연구부의 자금 지원을 받았습니다.

Materials

4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 
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References

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Citer Cet Article
Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).
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