Na infecção por Mycoplasma pneumoniae, os exames de sorologia podem gerar bons resultados, porém com baixa especificidade devido à reação cruzada imunológica. O ELISA interno de captura de antígenos, descrito neste artigo, garante alta especificidade de espécies e tem se mostrado um teste de triagem confiável para o diagnóstico preciso de M. pneumoniae.
O Mycoplasma pneumoniae é um procariota deficiente em parede celular, conhecido principalmente por colonizar o trato respiratório humano e ser endêmico, com picos epidêmicos a cada 6 anos, em crianças mais velhas e adultos jovens. O diagnóstico de M. pneumoniae é um desafio devido à natureza fastidiosa do patógeno e à possibilidade de transporte assintomático. O diagnóstico laboratorial da infecção por M. pneumoniae com base na titulação de anticorpos nas amostras de soro dos pacientes continua sendo o método mais praticado. Devido ao potencial problema de reatividade cruzada imunológica com o uso de soro policlonal para M. pneumoniae, um ensaio imunoenzimático de captura de antígenos (ELISA) foi desenvolvido para melhorar a especificidade do diagnóstico sorológico. As placas ELISA são revestidas com anticorpos policlonais de M. pneumoniae, criadas em coelhos e tornadas específicas após adsorção contra um painel de bactérias heterólogas que compartilham antígenos com espécies de M. pneumoniae e/ou são conhecidas por colonizar o trato respiratório. Os antígenos homólogos de M. pneumoniae reagidos são então especificamente reconhecidos por seus anticorpos correspondentes nas amostras de soro. Uma otimização adicional dos parâmetros físico-químicos aos quais o ELISA de captura de antígeno é submetido levou a um ELISA altamente específico, sensível e reprodutível.
Os micoplasmas estão entre os menores e mais simples procariontes conhecidos. Eles se distinguem principalmente de outras bactérias pela falta de uma estrutura de parede celular. Assim, os Mycoplasmas foram classificados em uma classe separada denominada Mollicutes1. A deficiência da parede celular confere resistência intrínseca a esses microrganismos contra alguns agentes antimicrobianos e é em grande parte responsável pelo seu polimorfismo. Os micoplasmas têm genoma pequeno e tamanho reduzido, o que limita suas capacidades metabólicas e biossintéticas e explica sua natureza parasitária e saprófita1.
O Mycoplasma pneumoniae é um dos Mycoplasmas que infectam o homem e acredita-se que seja o mais virulento2. M. pneumoniae coloniza o trato respiratório superior, levando a pneumonia atípica em crianças e adultos jovens. Os sinais clínicos engendrados pela infecção por M. pneumoniae são gripais, com cefaleia, febre e tosse3. A ciaderência de M. pneumoniae às células hospedeiras é mediada por uma organela de fixação que inclui a adesão maior de P1 e várias proteínas acessórias 4,5. Mais manifestações clínicas podem ocorrer devido à inflamação local e estimulação do sistema imunológico do hospedeiro resultante da adesão íntima de M. pneumoniae à mucosa das vias aéreas6. Embora a pneumonia seja uma característica da infecção por M. pneumoniae, tem sido revelado que a infecção por essa bactéria também pode ser responsável por um amplo espectro de manifestações não pulmonares em diferentes locais anatômicos, como sistema nervoso central, coração, pele e articulações7.
Como para todas as espécies de Mycoplasma, o diagnóstico de M. pneumoniae é desafiador. Os sinais clínicos que evocam micoplasmose são, em sua maioria, inaparentes e não característicos8. Como é muito difícil diagnosticar a infecção por M. pneumoniae baseando-se apenas em manifestações e sintomas clínicos, o rastreamento laboratorial é de particular interesse9. A detecção de colônias de M. pneumoniae por cultura é o método padrão-ouro para um diagnóstico adequado. No entanto, as necessidades de crescimento exigente e o longo tempo necessário para a entrega de resultados definitivos (1-2 semanas) complicam a cultura e, portanto, significam que ela raramente é usada para o diagnóstico de rotina10. As tecnologias de amplificação de ácido nucleico foram validadas em termos de velocidade e eficiência, embora devido ao seu custo relativamente alto e indisponibilidade em algumas unidades de saúde, essas técnicas moleculares não sejam consideradas testes diagnósticos de primeira linha. É verdade que os testes PCR comerciais são amplamente utilizados para diagnosticar infecções por M. pneumoniae, mas ainda não podem substituir a sorologia. Além disso, a ocorrência frequente de resultados falsos negativos e falsos positivos limitou o uso da PCR9. Rotineiramente, a sorologia continua sendo a mais praticada em laboratórios para o diagnóstico da infecção por M. pneumoniae. Várias abordagens sorológicas têm sido relatadas há décadas, como hemaglutininas frias, teste de fixação do complemento 11, teste de hemaglutinação indireta12, imunofluorescência 13 e a tecnologia ELISA, que foi aplicada pela primeira vez à sorologia para micoplasma no início da década de 198014,15,16. Um dos principais problemas encontrados ao realizar o sorodiagnóstico por ELISA da infecção por M. pneumoniae são as reações cruzadas, o que reduz consideravelmente a especificidade da técnica. A adsorção inespecífica de soros humanos com antígenos de M. pneumoniae foi previamente relatada; de fato, muitos dos anticorpos detectados pelo ELISA em soros humanos podem nem sempre estar ligados a antígenos micoplasmáticos 17, devido à semelhança de M. pneumoniae com algumas bactérias18,19 e alguns tecidos animais e humanos20.
Devido às altas leituras de fundo observadas no teste ELISA convencional que foi praticado em laboratório, a interpretação dos resultados foi muitas vezes complicada e, portanto, a entrega de um diagnóstico adequado de M. pneumoniae foi uma tarefa difícil. Ao enfrentar esse problema, optamos por melhorar o ELISA de M. pneumoniae removendo reações inespecíficas de antígenos de M. pneumoniae com anticorpos a serem testados . Para tanto, foi trabalhada a depleção seletiva dos antígenos inespecíficos de M. pneumoniae utilizando a técnica de adsorção. De fato, o principal objetivo do ELISA de captura de antígeno é detectar especificamente a imunoglobulina (Ig) G de M. pneumoniae em amostras de soro humano. O conceito deste ELISA consiste principalmente na captura seletiva de antígenos específicos de M. pneumoniae, antes da adição das amostras de soro humano. Esta seletividade é assegurada pela incubação do antígeno bruto de M. pneumoniae com um antissoro policlonal de M. pneumoniae, produzido em coelhos em laboratório e tornando-o espécie-específico por adsorção contra um painel de bactérias heterólogas, pertencentes ou não à classe Mollicus, compartilhando antígenos com M. pneumoniae espécies e/ou conhecidas por colonizar o trato respiratório. O procedimento de adsorção foi repetido três vezes, e sua eficiência para eliminar a reatividade cruzada foi testada por immunoblotting. O ensaio ELISA desenvolvido é uma combinação de sanduíche e ELISA indireto. Resumidamente, os poços da placa ELISA são primeiro revestidos com um antissoro policlonal específico para M. pneumoniae. Em seguida, o antígeno de M. pneumoniae é adicionado e preso entre o antissoro e os anticorpos presentes na amostra de soro a ser testada. O complexo imunológico formado é detectado por um anticorpo conjugado enzimático secundário (IgG conjugada com peroxidase). As reações são visualizadas pela adição de substrato cromogênico, e a absorbância é medida espectrofotometricamente. Esse ELISA interno é apresentado esquematicamente na Figura 1. O ELISA caseiro mostrou-se eficiente na detecção específica da infecção por M. pneumoniae e é atualmente um dos testes mais praticados na atividade diagnóstica de rotina.
Este artigo apresenta uma descrição geral de um ELISA interno desenvolvido principalmente para garantir a triagem específica de M. pneumoniae Infeção. Os detalhes sobre o protocolo do ensaio ELISA em si, bem como algumas etapas de pré e pós-processamento são fornecidos. A especificidade deste ensaio é assegurada pela técnica de adsorção. Este procedimento foi previamente descrito em testes ELISA desenvolvidos para o diagnóstico de humanos e aves Mycoplasmas17,</…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado pelo Ministério da Saúde da Tunísia e pelo Ministério do Ensino Superior e Investigação Científica da Tunísia.
4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
Bacto peptone | BD | 211677 | |
Bacto tryptone | BD | 211705 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
Thimerosal | USB | 22215 | |
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |