Антиген-захват фермент-связанный иммуносорбентный анализ для специфического обнаружения Mycoplasma pneumoniae
Summary
При инфекции Mycoplasma pneumoniae серологические тесты могут давать хорошие результаты, но с низкой специфичностью из-за иммунологической перекрестной реакции. Собственный ИФА захвата антигена, описанный в этой статье, гарантирует высокую видовую специфичность и, как было показано, является надежным скрининговым тестом для точной диагностики M. pneumoniae.
Abstract
Mycoplasma pneumoniae – это прокариот с дефицитом клеточной стенки, который, как известно, в основном колонизирует дыхательные пути человека и является эндемичным, с эпидемическим пиком каждые 6 лет, у детей старшего возраста и молодых людей. Диагностика M. pneumoniae является сложной задачей из-за привередливой природы возбудителя и возможности бессимптомного носительства. Лабораторная диагностика инфекции M. pneumoniae на основе титрования антител в образцах сыворотки пациентов остается наиболее практикуемым методом. Из-за потенциальной проблемы иммунологической перекрестной реактивности с использованием поликлональной сыворотки для M. pneumoniae был разработан иммуносорбентный анализ антиген-захвата (ИФА) для улучшения специфичности серологической диагностики. Пластины ИФА покрыты поликлональными антителами M. pneumoniae , выращенными у кроликов и специфичными после адсорбции против панели гетерологичных бактерий, которые разделяют антигены с видами M. pneumoniae и/ или, как известно, колонизируют дыхательные пути. Реагирующие гомологичные антигены M. pneumoniae затем специфически распознаются по соответствующим антителам в образцах сыворотки. Дальнейшая оптимизация физико-химических параметров, которым подвергается ИФА захвата антигена, привела к получению высокоспецифичного, чувствительного и воспроизводимого ИФА.
Introduction
Микоплазмы являются одними из самых маленьких и простых известных прокариот. Они в основном отличаются от других бактерий отсутствием структуры клеточной стенки. Таким образом, микоплазмы были классифицированы в отдельный класс под названием Mollicutes1. Дефицит клеточной стенки придает внутреннюю устойчивость этим микроорганизмам против некоторых антимикробных агентов и в значительной степени отвечает за их полиморфизм. Микоплазмы имеют малый геном и уменьшенные размеры, что ограничивает их метаболические и биосинтетические возможности и объясняет их паразитарную и сапрофитную природу1.
Mycoplasma pneumoniae является одной из микоплазм, которые заражают человека, и считается самой вирулентной2. M. pneumoniae колонизирует верхние дыхательные пути, что приводит к атипичной пневмонии у детей и молодых людей. Клинические признаки, порожденные инфекцией M. pneumoniae, похожи на грипп, с головной болью, лихорадкой и кашлем3. Цитадренция M. pneumoniae к клеткам-хозяева опосредована органеллой прикрепления, включающей большую адгезию P1 и несколько вспомогательных белков 4,5. Более клинические проявления могут возникать из-за местного воспаления и стимуляции иммунной системы хозяина в результате тесного присоединения M. pneumoniae к слизистой оболочке дыхательных путей6. Хотя пневмония является отличительной чертой инфекции M. pneumoniae, было выявлено, что инфекция этой бактерией также может быть ответственна за широкий спектр нелегочных проявлений в различных анатомических местах, таких как центральная нервная система, сердце, кожа и суставы7.
Как и для всех видов Mycoplasma, диагностика M. pneumoniae является сложной. Клинические признаки, вызывающие микоплазмоз, в основном неочевидные и нехарактерные8. Поскольку очень трудно диагностировать инфекцию M. pneumoniae, полагаясь только на клинические проявления и симптомы, лабораторный скрининг представляет особый интерес9. Обнаружение колоний M. pneumoniae по культуре является золотым стандартом для правильной диагностики. Однако привередливые требования к росту и длительное время, необходимое для доставки окончательных результатов (1-2 недели), усложняют культуру и, таким образом, означают, что она редко используется для рутинной диагностики10. Технологии амплификации нуклеиновых кислот были проверены с точки зрения скорости и эффективности, хотя из-за их относительно высокой стоимости и недоступности в некоторых медицинских учреждениях эти молекулярные методы не считаются диагностическими тестами первой линии. Это правда, что коммерческие ПЦР-тесты широко используются для диагностики инфекций M. pneumoniae, но они все еще не могут заменить серологию. Кроме того, частое появление как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов ограничило использование ПЦР9. Как правило, серология остается наиболее практикуемой в лабораториях для диагностики инфекции M. pneumoniae. В течение десятилетий сообщалось о нескольких серологических подходах, таких как холодные гемагглютинины, тест фиксации комплемента11, тест на непрямую гемагглютинацию12, иммунофлуоресценция13 и технология ИФА, которая была впервые применена к серологии микоплазмы в начале 1980-х годов 14,15,16. Одной из основных проблем, возникающих при выполнении ИФА-серодиагностики инфекции M. pneumoniae, являются перекрестные реакции, что значительно снижает специфичность методики. Ранее сообщалось о неспецифической адсорбции сывороток человека антигенами M. pneumoniae; на самом деле, многие из антител, обнаруженных с помощью ИФА в сыворотках человека, не всегда могут быть связаны с микоплазмальными антигенами17 из-за общности M. pneumoniae с некоторыми бактериями18,19 и некоторыми тканями животных и человека20.
Из-за высоких фоновых показаний, наблюдаемых в обычном тесте ИФА, который практиковался в лаборатории, интерпретация результатов часто была сложной, и, таким образом, постановка правильного диагноза M. pneumoniae была трудным заданием. Столкнувшись с этой проблемой, мы решили улучшить ИФА M. pneumoniae , удалив неспецифические реакции антигенов M. pneumoniae с антителами, подлежащими тестированию. С этой целью мы работали над селективным истощением неспецифических антигенов M. pneumoniae с использованием метода адсорбции. Фактически, основной целью ИФА захвата антигена является конкретное обнаружение иммуноглобулина M. pneumoniae (Ig) G в образцах сыворотки крови человека. Концепция этого ИФА состоит в основном из селективного захвата специфических антигенов M. pneumoniae, перед добавлением образцов сыворотки крови человека. Эта селективность обеспечивается инкубацией сырого антигена M. pneumoniae с поликлональной антисывороткой M. pneumoniae , продуцируемой у кроликов в лаборатории, и превращением ее в видоспецифичным путем адсорбции против группы гетерологичных бактерий, принадлежащих или не принадлежащих к классу Mollicutes, разделяющих антигены с M. pneumoniae виды и/или известные колонизирующие дыхательные пути. Процедуру адсорбции повторяли трижды, а ее эффективность по устранению перекрестной реактивности проверяли иммуноблоттингом. Разработанный ИФА-анализ представляет собой комбинацию сэндвича и непрямого ИФА. Вкратце, колодцы ИФА-пластины сначала покрываются поликлональной антисывороткой, специфичной для M. pneumoniae. Затем добавляется антиген M. pneumoniae и захватывается между антисывороткой и антителами, присутствующими в образце сыворотки для тестирования. Сформированный иммунологический комплекс обнаруживается вторичным фермент-конъюгированным антителом (пероксидазо-конъюгированный IgG). Реакции визуализируются добавлением хромогенного субстрата, а поглощение измеряется спектрофотометрически. Этот внутренний ИФА схематично представлен на рисунке 1. Домашний ИФА оказался эффективным в выявлении инфекции M. pneumoniae и в настоящее время является одним из наиболее практикуемых тестов в рутинной диагностической деятельности.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем документе представлено общее описание собственной ИФА, в основном разработанной для обеспечения специфического скрининга M. pneumoniae инфекция. Приведены подробности о протоколе самого анализа ИФА, а также о некоторых этапах предварительной и постобработки. Специфика эт?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Министерством здравоохранения Туниса и Министерством высшего образования и научных исследований Туниса.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
References
- Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
- Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
- Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
- Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
- Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
- Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
- Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
- Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
- Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
- Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
- Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).
- Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
- Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
- Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
- Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
- Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
- Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
- Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
- Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
- Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
- Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
- Fawcett, P. T., O’Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
- Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
- Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).
- Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
- Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
- Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
- Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
- Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
- Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
- Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
- Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
