JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Mycoplasma pneumoniae'nin Spesifik Tespiti için Antijen Yakalama Enzimine Bağlı İmmünosorbent Testi

Published: February 24, 2023
doi:
10.3791/64645
, , , ,
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development,Pasteur Institute of Tunis

Summary

Mycoplasma pneumoniae enfeksiyonunda, seroloji testleri immünolojik çapraz reaksiyon nedeniyle düşük özgüllükle iyi sonuçlar verebilir. Bu yazıda açıklanan kurum içi antijen yakalama ELISA, yüksek tür özgüllüğünü garanti eder ve M. pneumoniae’nin doğru teşhisi için güvenilir bir tarama testi olduğu gösterilmiştir.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae, esas olarak insan solunum yollarını kolonize ettiği ve endemik olduğu bilinen, daha büyük çocuklarda ve genç erişkinlerde her 6 yılda bir epidemik zirvelere ulaşan, hücre duvarı eksikliği olan bir prokaryottur. M. pneumoniae’nin teşhisi, patojenin titiz doğası ve asemptomatik taşıma olasılığı nedeniyle zordur. M. pneumoniae enfeksiyonunun hastaların serum örneklerinde antikor titrasyonuna dayalı laboratuvar tanısı en çok uygulanan yöntem olmaya devam etmektedir. M. pneumoniae için poliklonal serum kullanımı ile immünolojik çapraz reaktivitenin potansiyel problemi nedeniyle, serolojik tanının özgüllüğünü arttırmak için antijen yakalama enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) geliştirilmiştir. ELISA plakaları M. pneumoniae poliklonal antikorları ile kaplanır, tavşanlarda yetiştirilir ve M. pneumoniae türleri ile antijenleri paylaşan ve / veya solunum yollarını kolonize ettiği bilinen heterolog bakterilerden oluşan bir panele karşı adsorpsiyondan sonra spesifik hale getirilir. Reaksiyona giren M. pneumoniae homolog antijenleri daha sonra serum örneklerinde karşılık gelen antikorları tarafından özel olarak tanınır. Antijen yakalama ELISA’sının maruz kaldığı fizikokimyasal parametrelerin daha fazla optimizasyonu, oldukça spesifik, hassas ve tekrarlanabilir bir ELISA’ya yol açmıştır.

Introduction

Mikoplazmalar bilinen en küçük ve en basit prokaryotlar arasındadır. Esas olarak bir hücre duvarı yapısının olmaması ile diğer bakterilerden ayırt edilirler. Böylece, Mikoplazmalar Mollicutes1 adlı ayrı bir sınıfta sınıflandırıldı. Hücre duvarı eksikliği, bazı antimikrobiyal ajanlara karşı bu mikroorganizmalara içsel direnç kazandırır ve polimorfizmlerinden büyük ölçüde sorumludur. Mikoplazmalar , metabolik ve biyosentetik yeteneklerini sınırlayan ve parazitik ve saprofitik doğalarını açıklayan küçük genoma ve küçültülmüş boyuta sahiptir1.

Mycoplasma pneumoniae, insanı enfekte eden Mikoplazmalardan biridir ve en virülan2 olduğu düşünülmektedir. M. pneumoniae, üst solunum yollarını kolonize ederek çocuklarda ve genç erişkinlerde atipik pnömoniye yol açar. M. pneumoniae enfeksiyonunun yol açtığı klinik bulgular grip benzeri, baş ağrısı, ateş ve öksürük3’tür. M. pneumoniae’nin konakçı hücrelere olan sitaderansına, P1 majör adezyonu ve birkaç aksesuar proteini içeren bir ataşman organeli aracılık eder 4,5. M. pneumoniae’nin hava yolu mukozasına yakın yapışmasından kaynaklanan lokal inflamasyon ve konakçı bağışıklık sisteminin uyarılması nedeniyle daha fazla klinik bulgu ortaya çıkabilir6. Pnömoni, M. pneumoniae enfeksiyonunun ayırt edici bir özelliği olmasına rağmen, bu bakteri ile enfeksiyonun, merkezi sinir sistemi, kalp, cilt ve eklemler gibi farklı anatomik bölgelerde geniş bir pulmoner olmayan bulgular spektrumundan da sorumlu olabileceği ortaya konmuştur7.

Tüm Mycoplasma türlerine gelince, M. pneumoniae’nin teşhisi zordur. Mikoplazmozu çağrıştıran klinik bulgular çoğunlukla görünmez ve karakteristik değildir8. M. pneumoniae enfeksiyonunu sadece klinik bulgulara ve semptomlara dayanarak teşhis etmek çok zor olduğundan, laboratuvar taraması özellikle ilgi çekicidir9. M. pneumoniae kolonilerinin kültür yoluyla saptanması doğru tanı için altın standart yöntemdir. Bununla birlikte, titiz büyüme gereksinimleri ve kesin sonuçların verilmesi için gereken uzun süre (1-2 hafta) kültürü karmaşıklaştırır ve bu nedenle rutin tanı için nadiren kullanıldığı anlamına gelir10. Nükleik asit amplifikasyon teknolojileri hız ve verimlilik açısından doğrulanmıştır, ancak bazı sağlık tesislerinde nispeten yüksek maliyetleri ve kullanılamamaları nedeniyle, bu moleküler teknikler birinci basamak tanı testleri olarak kabul edilmemektedir. Ticari PCR testlerinin M. pneumoniae enfeksiyonlarını teşhis etmek için yaygın olarak kullanıldığı doğrudur, ancak yine de serolojinin yerini alamazlar. Ayrıca, hem yanlış negatif hem de yanlış pozitif sonuçların sık görülmesi, PCR9’un kullanımını sınırlamıştır. Rutin olarak, seroloji, M. pneumoniae enfeksiyonunun teşhisi için laboratuvarlarda en çok uygulanan yöntem olmaya devam etmektedir. Soğuk hemaglutininler, kompleman fiksasyon testi11, dolaylı hemaglutinasyon testi 12, immünofloresan 13 ve ilk olarak 1980’lerin başında mikoplazma serolojisine uygulanan ELISA teknolojisi14,15,16 gibi çeşitli seroloji yaklaşımları on yıllardır bildirilmiştir. M. pneumoniae enfeksiyonunun ELISA serodiagnostiği yapılırken karşılaşılan en önemli sorunlardan biri, tekniğin özgüllüğünü önemli ölçüde azaltan çapraz reaksiyonlardır. İnsan serumlarının M. pneumoniae antijenleri ile spesifik olmayan adsorpsiyonu daha önce bildirilmiştir; Aslında, insan serumlarında ELISA tarafından tespit edilen antikorların çoğu, M. pneumoniae’nin bazı bakteriler 18,19 ve bazı hayvan ve insan dokuları20 ile ortaklığından dolayı her zaman mikoplazmal antijenlere 17 bağlı olmayabilir.

Laboratuvarda uygulanan geleneksel ELISA testinde gözlenen yüksek arka plan okumaları nedeniyle, sonuçların yorumlanması genellikle karmaşıktı ve bu nedenle uygun bir M. pneumoniae tanısının verilmesi zor bir görevdi. Bu sorunla karşı karşıya kalırken, M. pneumoniae antijenlerinin spesifik olmayan reaksiyonlarını test edilecek antikorlarla ortadan kaldırarak M. pneumoniae ELISA’yı iyileştirmeyi seçtik. Bu amaçla, adsorpsiyon tekniğini kullanarak spesifik olmayan M. pneumoniae antijenlerinin seçici tükenmesi üzerinde çalıştık. Aslında, antijen yakalama ELISA’nın temel amacı, insan serum örneklerinde M. pneumoniae immunoglobulin (Ig) G’yi spesifik olarak tespit etmektir. Bu ELISA kavramı, esas olarak, insan serum örneklerini eklemeden önce, M. pneumoniae-spesifik antijenlerin seçici olarak yakalanmasından oluşur. Bu seçicilik, laboratuvarda tavşanlarda üretilen M. pneumoniae ham antijeninin M. pneumoniae poliklonal antiserum ile inkübe edilmesi ve Mollicutes sınıfına ait olan veya olmayan heterolog bakterilerden oluşan bir panele karşı adsorpsiyon yoluyla türe özgü hale getirilmesi, antijenlerin M. pneumoniae ile paylaşılmasıyla sigortalanır. türler ve / veya solunum yollarını kolonize ettiği bilinmektedir. Adsorpsiyon prosedürü üç kez tekrarlandı ve çapraz reaktiviteyi ortadan kaldırma etkinliği immünoblotlama ile test edildi. Geliştirilen ELISA testi, sandviç ve dolaylı ELISA’nın bir kombinasyonudur. Kısaca, ELISA plakasının kuyucukları ilk önce M. pneumoniae’ye özgü bir poliklonal antiserum ile kaplanır. Daha sonra, M. pneumoniae antijeni eklenir ve antiserum ile test edilecek serum örneğinde bulunan antikorlar arasında sıkışır. Oluşan immünolojik kompleks, ikincil bir enzim konjuge antikoru (peroksidaz konjuge IgG) ile tespit edilir. Reaksiyonlar kromojenik substratın eklenmesiyle görselleştirilir ve absorbans spektrofotometrik olarak ölçülür. Bu kurum içi ELISA, şematik olarak Şekil 1’de sunulmuştur. Ev yapımı ELISA, M. pneumoniae enfeksiyonunu spesifik olarak tespit etmede etkili olduğunu kanıtladı ve şu anda rutin tanı aktivitesinde en çok uygulanan testlerden biridir.

Protocol

Bu çalışma, Tunus Pasteur Enstitüsü etik kurulu tarafından oluşturulan etik yönlere uygun olarak yürütülmüştür. 1. ELISA öncesi adımlar: Önkoşullar ve ön işleme Bakteri suşları ve büyüme ortamıNOT: Bu çalışmada kullanılan Mollicutes türleri ve duvarlı bakteriler ile bunların büyüme ortamları Tablo 1’de listelenmiştir.Mollicutes türlerinin büyümesiOrtamın 1.800 μL’sinde her türün gliserol …

Representative Results

Adsorbe edilmemiş poliklonal Mycoplasma pneumoniae antiserumunun heterolog bakterilere karşı immünoblotlama aktivitesiÇapraz reaktivite, immünoblotlama sonuçlarında (Şekil 2) görüldüğü gibi gerçekten de mevcuttur ve pozitif kontrol (Şerit 1) ile karşılaştırıldığında, M. pneumoniae antijenlerinin bir kısmı taranan bakterilerle paylaşılmaktadır. Bu çapraz reaksiyonların yoğunluğu değişke…

Discussion

Bu makale, esas olarak spesifik taramayı sağlamak için geliştirilen kurum içi ELISA’nın genel bir tanımını sunmaktadır. M. pneumoniae enfeksiyon. ELISA testinin kendisinin protokolü ve bazı işlem öncesi ve sonrası adımlar hakkında ayrıntılar sağlanmaktadır. Bu tahlilin özgüllüğü adsorpsiyon tekniği ile sağlanır. Bu prosedür daha önce insan ve kuş tanısı için geliştirilen ELISA testlerinde tanımlanmıştır. Mycoplasmas17,<sup class=…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Tunus Sağlık Bakanlığı ve Tunus Yüksek Öğretim ve Bilimsel Araştırma Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir.

Materials

4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O’Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  34. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  35. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  36. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Tags

Antigen-Capture ELISAMycoplasma PneumoniaeSpecific DetectionCross-reaction DepletionAdsorption TechniqueHigh SpecificityReliable Screening TestHeterologous Bacterial AntigensPolyclonal Anti-Mycoplasma Pneumoniae IgGCapture AntibodyBlocking SolutionMycoplasma Pneumoniae Whole ProteinsHuman Serum Test SamplesReference Positive And Negative Serum Controls

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image