Antigen-Capture Enzyme-linked Immunosorbent Assay zum spezifischen Nachweis von Mycoplasma pneumoniae
Summary
Bei einer Infektion mit Mycoplasma pneumoniae können serologische Tests gute Ergebnisse liefern, jedoch aufgrund einer immunologischen Kreuzreaktion mit geringer Spezifität. Der hauseigene Antigen-Capture-ELISA, der in diesem Artikel beschrieben wird, garantiert eine hohe Speziesspezifität und hat sich als zuverlässiger Screening-Test für die genaue Diagnose von M. pneumoniae erwiesen.
Abstract
Mycoplasma pneumoniae ist ein Prokaryot mit Zellwandmangel, der hauptsächlich dafür bekannt ist, die menschlichen Atemwege zu besiedeln und bei älteren Kindern und jungen Erwachsenen endemisch zu sein, mit epidemischen Spitzen alle 6 Jahre. Die Diagnose von M. pneumoniae ist aufgrund der anspruchsvollen Natur des Erregers und der Möglichkeit einer asymptomatischen Übertragung schwierig. Die Labordiagnostik der M. pneumoniae-Infektion auf der Grundlage der Antikörpertitration in den Serumproben von Patienten ist nach wie vor die am meisten praktizierte Methode. Aufgrund des potenziellen Problems der immunologischen Kreuzreaktivität bei der Verwendung von polyklonalem Serum für M. pneumoniae wurde ein Enzym-Capture-Enzym-Immunoassay (ELISA) entwickelt, um die Spezifität der serologischen Diagnose zu verbessern. ELISA-Platten sind mit polyklonalen Antikörpern von M. pneumoniae beschichtet, die bei Kaninchen gezüchtet und nach Adsorption gegen eine Gruppe heterologer Bakterien spezifisch gemacht werden, die Antigene mit M. pneumoniae-Arten teilen und/oder von denen bekannt ist, dass sie die Atemwege besiedeln . Die umgesetzten homologen M. pneumoniae-Antigene werden dann spezifisch durch ihre entsprechenden Antikörper in den Serumproben erkannt. Eine weitere Optimierung der physikalisch-chemischen Parameter, denen der Antigen-Capture-ELISA ausgesetzt ist, führte zu einem hochspezifischen, sensitiven und reproduzierbaren ELISA.
Introduction
Mykoplasmen gehören zu den kleinsten und einfachsten bekannten Prokaryoten. Sie unterscheiden sich von anderen Bakterien vor allem durch das Fehlen einer Zellwandstruktur. Daher wurden Mykoplasmen in eine eigene Klasse namens Mollicutes1 eingeordnet. Der Zellwandmangel verleiht diesen Mikroorganismen eine intrinsische Resistenz gegen einige antimikrobielle Wirkstoffe und ist weitgehend für deren Polymorphie verantwortlich. Mykoplasmen haben ein kleines Genom und eine reduzierte Größe, was ihre metabolischen und biosynthetischen Fähigkeiten einschränkt und ihre parasitäre und saprophytische Natur erklärt1.
Mycoplasma pneumoniae ist eines der Mykoplasmen, die den Menschen infizieren und gilt als das virulenteste2. M. pneumoniae besiedelt die oberen Atemwege, was bei Kindern und jungen Erwachsenen zu einer atypischen Lungenentzündung führt. Die klinischen Symptome, die durch eine Infektion mit M. pneumoniae hervorgerufen werden, sind grippeähnlich mit Kopfschmerzen, Fieber und Husten3. Die Cytadhärenz von M. pneumoniae an Wirtszellen wird durch eine Bindungsorganelle vermittelt, die P1-Hauptadhäsion und mehrere akzessorische Proteineenthält 4,5. Weitere klinische Manifestationen können aufgrund einer lokalen Entzündung und Stimulation des Immunsystems des Wirts auftreten, die sich aus der engen Anhaftung von M. pneumoniae an die Atemwegsschleimhautergeben 6. Obwohl Lungenentzündung ein Kennzeichen der Infektion mit M. pneumoniae ist, hat sich gezeigt, dass eine Infektion mit diesem Bakterium auch für ein breites Spektrum nicht-pulmonaler Manifestationen an verschiedenen anatomischen Stellen wie dem zentralen Nervensystem, dem Herzen, der Haut und den Gelenken verantwortlich sein kann7.
Wie bei allen Mykoplasmenarten ist die Diagnose von M. pneumoniae eine Herausforderung. Die klinischen Symptome, die an eine Mykoplasmose erinnern, sind meist inapparent, und nicht charakteristisch8. Da es sehr schwierig ist, eine Infektion mit M. pneumoniae zu diagnostizieren, wenn man sich nur auf klinische Manifestationen und Symptome verlässt, ist das Laborscreening von besonderem Interesse9. Der Nachweis von M. pneumoniae-Kolonien durch Kultur ist die Goldstandardmethode für eine korrekte Diagnose. Die anspruchsvollen Wachstumsanforderungen und die lange Zeit, die für die Bereitstellung endgültiger Ergebnisse benötigt wird (1-2 Wochen), erschweren die Kultur jedoch und bedeuten daher, dass sie selten für die Routinediagnose verwendet wird10. Nukleinsäure-Amplifikationstechnologien wurden in Bezug auf Geschwindigkeit und Effizienz validiert, obwohl diese molekularen Techniken aufgrund ihrer relativ hohen Kosten und der Nichtverfügbarkeit in einigen Gesundheitseinrichtungen nicht als Erstlinien-Diagnosetests gelten. Es ist wahr, dass kommerzielle PCR-Tests weit verbreitet sind, um M. pneumoniae-Infektionen zu diagnostizieren, aber sie können die Serologie immer noch nicht ersetzen. Auch das häufige Auftreten von falsch negativen und falsch positiven Ergebnissen hat den Einsatz von PCR9 eingeschränkt. Routinemäßig ist die Serologie in Laboratorien nach wie vor die am meisten praktizierte für die Diagnose einer M. pneumoniae-Infektion. Seit Jahrzehnten wird über mehrere serologische Ansätze berichtet, wie z. B. kalte Hämagglutinine, Komplementbindungstest11, indirekter Hämagglutinationstest 12, Immunfluoreszenz 13 und die Technologie des ELISA, die erstmals in den frühen 1980er Jahren in der Mykoplasmenserologie angewendet wurde14,15,16. Eines der Hauptprobleme bei der Durchführung der ELISA-Serodiagnostik einer Infektion mit M. pneumoniae sind Kreuzreaktionen, die die Spezifität der Technik erheblich verringern. Unspezifische Adsorption menschlicher Seren mit M. pneumoniae-Antigenen wurde bereits berichtet; Tatsächlich sind viele der durch ELISA in menschlichen Seren nachgewiesenen Antikörper möglicherweise nicht immer an Mykoplasmenantigene 17 gebunden, was auf die Gemeinsamkeit von M. pneumoniae mit einigen Bakterien18,19 und einigen tierischen und menschlichen Geweben20 zurückzuführen ist.
Aufgrund der hohen Hintergrundwerte, die im herkömmlichen ELISA-Test beobachtet wurden, der im Labor praktiziert wurde, war die Interpretation der Ergebnisse oft kompliziert, und daher war die Bereitstellung einer korrekten M. pneumoniae-Diagnose eine schwierige Aufgabe. Angesichts dieses Problems haben wir uns entschieden, den M. pneumoniae ELISA zu verbessern, indem wir unspezifische Reaktionen von M. pneumoniae-Antigenen mit zu testenden Antikörpern entfernen. Zu diesem Zweck arbeiteten wir an der selektiven Depletion der unspezifischen M. pneumoniae-Antigene mit Hilfe der Adsorptionstechnik. Tatsächlich besteht das Hauptziel des Antigen-Capture-ELISA darin, M. pneumoniae Immunglobulin (Ig) G in humanen Serumproben spezifisch nachzuweisen. Das Konzept dieses ELISA besteht hauptsächlich aus dem selektiven Einfangen von M. pneumoniae-spezifischen Antigenen vor der Zugabe der humanen Serumproben. Diese Selektivität wird sichergestellt, indem das rohe Antigen von M. pneumoniae mit einem polyklonalen Antiserum von M. pneumoniae, das bei Kaninchen im Labor hergestellt wird, inkubiert und durch Adsorption gegen eine Gruppe heterologer Bakterien, die zur Klasse der Mollicutes gehören oder nicht, artspezifisch gemacht wird und Antigene mit M. pneumoniae teilt Arten und/oder von denen bekannt ist, dass sie die Atemwege besiedeln. Das Adsorptionsverfahren wurde dreimal wiederholt, und seine Wirksamkeit zur Eliminierung der Kreuzreaktivität wurde durch Immunoblotting getestet. Der entwickelte ELISA-Assay ist eine Kombination aus Sandwich- und indirektem ELISA. Kurz gesagt, die Vertiefungen der ELISA-Platte werden zunächst mit einem polyklonalen Antiserum beschichtet, das spezifisch für M. pneumoniae ist. Dann wird das M. pneumoniae-Antigen zugegeben und zwischen dem Antiserum und den Antikörpern eingeschlossen, die in der zu testenden Serumprobe vorhanden sind. Der gebildete immunologische Komplex wird durch einen sekundären enzymkonjugierten Antikörper (Peroxidase-konjugiertes IgG) detektiert. Die Reaktionen werden durch Zugabe von chromogenem Substrat sichtbar gemacht und die Absorption spektrophotometrisch gemessen. Dieser interne ELISA ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Der hausgemachte ELISA erwies sich als effizient bei der spezifischen Erkennung von M. pneumoniae-Infektionen und ist derzeit einer der am meisten praktizierten Tests in der Routinediagnostik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel enthält eine allgemeine Beschreibung eines internen ELISA, der hauptsächlich entwickelt wurde, um ein spezifisches Screening auf M. pneumoniae Infektion. Die Details über das Protokoll des ELISA-Assays selbst sowie einige Vor- und Nachbearbeitungsschritte werden bereitgestellt. Die Spezifität dieses Assays wird durch die Adsorptionstechnik sichergestellt. Dieses Verfahren wurde bereits in ELISA-Tests beschrieben, die für die Diagnose von Menschen und Vögeln entwickelt wurden Mycoplasmas<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom tunesischen Gesundheitsministerium und dem tunesischen Ministerium für Hochschulbildung und wissenschaftliche Forschung finanziert.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
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