Un insert innovant imprimé en 3D conçu pour permettre des cultures cellulaires 2D et 3D simples
Summary
Dans cet article, un insert nouvellement conçu imprimé en 3D est présenté comme un modèle de co-culture et validé par l’étude de la communication intercellulaire paracrine entre les cellules endothéliales et les kératinocytes.
Abstract
Les analyses classiques de la communication indirecte entre différents types de cellules nécessitent l’utilisation de milieux conditionnés. De plus, la production de milieux conditionnés reste chronophage et éloignée des conditions physiologiques et pathologiques. Bien que quelques modèles de co-culture soient disponibles dans le commerce, ils restent limités à des tests spécifiques et concernent principalement deux types de cellules.
Ici, on utilise des inserts imprimés en 3D qui sont compatibles avec de nombreux tests fonctionnels. L’insert permet la séparation d’un puits d’une plaque à 6 puits en quatre compartiments. Un large éventail de combinaisons peut être défini. De plus, des fenêtres sont conçues dans chaque paroi des compartiments de manière à ce que la communication intercellulaire potentielle entre chaque compartiment soit possible dans le milieu de culture d’une manière dépendante du volume. Par exemple, la communication intercellulaire paracrine peut être étudiée entre quatre types de cellules en monocouche, en 3D (sphéroïdes), ou en combinant les deux. De plus, un mélange de différents types de cellules peut être ensemencé dans le même compartiment au format 2D ou 3D (organoïdes). L’absence de fond dans les inserts imprimés en 3D permet les conditions de culture habituelles sur la plaque, un éventuel revêtement sur la plaque contenant l’insert, et une visualisation directe par microscopie optique. Les multiples compartiments offrent la possibilité de collecter différents types de cellules indépendamment ou d’utiliser, dans chaque compartiment, différents réactifs pour l’extraction d’ARN ou de protéines. Dans cette étude, une méthodologie détaillée est fournie pour utiliser le nouvel insert imprimé en 3D comme système de co-culture. Pour démontrer plusieurs capacités de ce modèle flexible et simple, des tests fonctionnels de communication cellulaire précédemment publiés ont été effectués dans les nouveaux inserts imprimés en 3D et se sont avérés reproductibles. Les inserts imprimés en 3D et la culture cellulaire conventionnelle à l’aide de milieux conditionnés ont conduit à des résultats similaires. En conclusion, l’insert imprimé en 3D est un dispositif simple qui peut être adapté à de nombreux modèles de co-cultures avec des types de cellules adhérentes.
Introduction
In vivo, les cellules communiquent entre elles soit directement (contact cellulaire), soit indirectement (par sécrétion de molécules). Pour étudier la communication cellulaire, différents modèles de co-culture peuvent être développés, tels que la co-culture directe (les différents types de cellules sont en interaction directe dans le même puits) et la co-culture compartimentée (les différents types de cellules sont en interaction indirecte dans différents compartiments d’un système de culture)1. De plus, les milieux conditionnés peuvent être utilisés pour les systèmes de co-culture, où l’interaction indirecte est rendue possible par le transfert de molécules sécrétées contenues dans le milieu conditionné d’un type de cellule effectrice à une cellule répondeusede type 1.
Dans le cas des études de communication cellulaire paracrine, les systèmes de co-culture indirecte fournissent des modèles qui reflètent fortement les interactions cellulaires in vivo. Des systèmes de co-culture indirecte ont été développés et commercialisés, permettant la mise en place de modèles de co-culture indirecte 2,3. Malheureusement, la plupart des systèmes de co-culture indirecte ne comportent que deux compartiments. D’autres systèmes de co-culture indirecte offrent plusieurs compartiments, mais ils sont moins évolutifs que le système décrit dans le présent manuscrit. Certains d’entre eux ne permettent pas une visualisation classique au microscope, et ils présentent souvent des méthodes d’application spécifiques. Dans plusieurs études, la communication paracrine entre différents types de cellules est sondée par le modèle de milieu conditionné 4,5,6,7. Il s’agit d’une méthode d’investigation plus facile par rapport aux systèmes de co-culture indirects, car elle ne nécessite pas de méthodes ou de matériaux spécifiques pour être établie1. D’autre part, la préparation des milieux conditionnés prend du temps et ne fournit des informations que sur la signalisation cellulaire unidirectionnelle (effecteur à répondeur)1.
Dans cet article, une nouvelle façon simple d’étudier la communication cellulaire est proposée. Permettant la combinaison de plusieurs types de cellules en interaction directe ou indirecte et dans des formats 2D ou 3D, les inserts imprimés présentent de nombreux avantages pour mettre en place facilement des modèles de co-culture. Adapté pour être placé dans les puits de plaques de 6 puits, l’insert imprimé en 3D est circulaire et permet de séparer le puits en quatre compartiments (deux grands compartiments et deux petits compartiments ; Graphique 1A). Les inserts imprimés en 3D se caractérisent par l’absence de fond. Ainsi, les cellules sont en contact direct avec la plaque sur laquelle l’insert est placé. De plus, chaque compartiment peut être revêtu indépendamment des autres. De plus, le comportement des cellules peut être facilement suivi au microscope optique. La présence de fenêtres de communication dans chaque paroi de l’insert permet l’ajout, au moment optimal, d’un support commun pour réaliser différentes expériences de co-culture. De nombreuses combinaisons de co-culture peuvent être réalisées pour étudier la communication directe et/ou indirecte entre plusieurs types de cellules. Par exemple, un modèle de co-culture indirecte entre quatre types de cellules différentes en monocouche et/ou en 3D (sphéroïdes) peut être conçu. Une combinaison de modèles de co-culture directe et indirecte peut également être réalisée en mélangeant différents types de cellules dans le même compartiment. L’effet de structures complexes (organoïdes, explants de tissus, etc.) sur différents types de cellules pourrait être un autre exemple de modèles qui peuvent être réalisés. De plus, les inserts imprimés en 3D sont compatibles avec les tests fonctionnels de biologie cellulaire (prolifération, migration, formation de pseudotubes, différenciation, etc.) et avec les tests de biochimie (extraction d’ADN, d’ARN, de protéines, de lipides, etc.). Enfin, les inserts imprimés en 3D offrent un large éventail de schémas expérimentaux de modèles de co-culture avec la possibilité de combiner simultanément différents tests dans la même expérience dans les différents compartiments.
Certaines capacités des inserts imprimés en 3D sont présentées pour les valider en tant que modèle de co-culture rapide et facile à utiliser. Par rapport à une étude précédemment publiée sur la communication des cellules paracrines, la capacité des inserts imprimés en 3D à être un modèle de co-culture précieux est démontrée. Pour évaluer ce point, la régulation de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales par les kératinocytes a été comparée entre le système d’insertion imprimé en 3D et le système classique utilisant des milieux conditionnés. Les inserts imprimés en 3D permettent d’obtenir rapidement des résultats similaires par rapport au système conventionnel utilisant des supports conditionnés. En effet, les inserts imprimés en 3D fournissent un modèle robuste pour étudier les interactions cellulaires dans les deux sens sans avoir besoin de produire des milieux conditionnés et avec la possibilité d’effectuer en parallèle les tests de prolifération et de migration dans la même expérience.
Pour conclure, dans cet article, un nouveau modèle prêt à l’emploi pour étudier la communication cellulaire est proposé. Compatibles avec tous les types de cellules adhérentes, les inserts imprimés en 3D permettent d’effectuer de nombreuses combinaisons de co-culture qui visent à se rapprocher des conditions in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La communication cellulaire indirecte est couramment étudiée à l’aide de milieux conditionnés ou de dispositifs de système de co-culture. La préparation des milieux conditionnés prend beaucoup de temps en amont des expériences, et cette méthode est limitée à des analyses unilatérales des effets. L’étude précédente de Colin-Pierre et al.8 à l’aide de milieux conditionnés a été menée sur la communication cellulaire indirecte entre deux types de cellules (HDMECs et …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été réalisée en collaboration avec BASF Beauty Care Solutions. Mme Charlie Colin-Pierre est doctorante financée par BASF et le CNRS.
Nous tenons à remercier M. Mehdi Sellami pour la conception des inserts imprimés en 3D.
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
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