JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

蛍光共鳴エネルギー移動による 生体内 におけるヒストン修飾酵素と転写因子の相互作用の解明

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、生細胞におけるタンパク質相互作用を検出するためのイメージング技術です。ここでは、ヒストン修飾酵素と、植物組織における遺伝子発現のエピジェネティックな調節のためにそれらを標的プロモーターに動員する転写因子との関連を研究するためのFRETプロトコルが提示されています。

Abstract

遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、転写抑制または活性化のためにそれぞれヘテロクロマティックまたはユークロマティックヒストンマークを生成するヒストン修飾酵素(HME)によって一般的に影響を受けます。HMEは、転写因子(TF)によって標的クロマチンにリクルートされます。したがって、HMEとTFの間の直接的な相互作用を検出して特徴付けることは、それらの機能と特異性をよりよく理解するために重要です。これらの研究は、生体組織内で in vivo で実施された場合、生物学的により関連性があります。ここでは、植物ヒストンデユビキチナーゼと植物転写因子との間の植物葉における相互作用を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて可視化するためのプロトコルを記述し、互いに<10nm以内にあるタンパク質分子間の複合体の検出を可能にする。FRET技術の2つのバリエーションが提示される:SE-FRETおよびAB-FRET(アクセプター漂白)は、エネルギーがドナーからアクセプターに非放射的に伝達されるか、アクセプターの光退色時にドナーによって放射的に放出される。SE-FRETとAB-FRETの両方のアプローチは、 プランタ内の他のタンパク質間の他の相互作用を発見するために容易に適応させることができます。

Introduction

植物ヒストンデユビキチナーゼは、ヒストンの翻訳後修飾、特にモノユビキチル化マークを消去することにより、遺伝子発現を制御する上で重要な役割を果たします1。これまでのところ、OTLD1はシロイヌナズナ2,3において分子レベルで特徴付けられる数少ない植物ヒストンデユビキチナーゼの1つである。OTLD1は、H2Bヒストン分子からモノユビキチン基を除去し、それによって標的遺伝子クロマチン4,5におけるH3ヒストンのユークロマティックアセチル化およびメチル化修飾の除去または付加を促進する。さらに、OTLD1は、別のクロマチン修飾酵素であるヒストンリジン脱メチル化酵素KDM1Cと相互作用して、標的遺伝子の転写抑制に影響を及ぼす6,7。

ほとんどのヒストン修飾酵素はDNA結合能力を欠いているため、標的遺伝子を直接認識することはできません。1つの可能性は、これらの酵素に結合し、それらをクロマチン標的に導くDNA結合転写因子タンパク質と協力することです。具体的には、植物では、いくつかの主要なヒストン修飾酵素(すなわち、ヒストンメチルトランスフェラーゼ8,9、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ10、ヒストンデメチラーゼ11、およびポリコーム抑制複合体12,13,14)が転写因子によってリクルートされることが知られている。この考えと一致して、最近、OTLD1と転写因子LSH1015との特異的なタンパク質間相互作用に基づく、標的プロモーターへのOTLD1リクルートメントの1つの可能なメカニズムが提案された。

LSH10は、中枢発生調節因子として機能する植物ALLOG(シロイヌナズナLSH1およびOryza G1)タンパク質のファミリーに属する16、17、18、19、20、21、22。ALOGタンパク質ファミリーのメンバーにDNA結合モチーフ23が含まれ、転写調節22、核局在19、およびホモ二量体化24の能力を示すという事実は、LSH10を含むこれらのタンパク質が転写のエピジェネティック調節中に特異的転写因子として作用する可能性があるという考えをさらに裏付けるものです。in vivoでのLSH10-OTLD1相互作用の特性評価に使用される主な実験技術の1つは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)15です。

FRETは、生細胞内のタンパク質同士25<10nm以内の近距離相互作用を直接検出するイメージング技術です。FRETアプローチ26には、増感発光(SE-FRET)(図1A)とアクセプター漂白(AB-FRET)(図1B)の2つの主要なバリエーションがあります。SE-FRETでは、相互作用するタンパク質(一方はドナー蛍光色素(例えば、緑色蛍光タンパク質、GFP)でタグ付けされ、もう一方はアクセプター蛍光色素(例えば、単量体赤色蛍光タンパク質、mRFP27,28)でタグ付けされ、励起状態エネルギーをドナーからアクセプターに非放射的に伝達する。この転送中に光子が放出されないため、アクセプターと同様の放射発光スペクトルを持つ蛍光シグナルが生成されます。AB-FRETでは、アクセプターが光退色によって永久に不活性化され、ドナーから伝達された非放射エネルギーを受け取ることができない場合、ドナーの放射放出の上昇に基づいてタンパク質相互作用が検出され、定量化されます(図1)。重要なことに、FRET蛍光の細胞内位置は、細胞内の相互作用タンパク質の局在を示すものである。

FRETを生体組織に展開し、相互作用タンパク質の細胞内局在を決定すると同時にこの相互作用自体を検出することができるため、FRETはin vivoでのタンパク質間相互作用の研究および初期特性評価に最適な技術となっています。同等のインビボ蛍光イメージング方法論である二分子蛍光相補(BiFC)29,30,31,32は、良好な代替アプローチであるが、FRETとは異なり、BiFCは自己蛍光BiFCレポーター33の自発的な集合により偽陽性を生じる可能性があり、そのデータの定量化はそれほど正確ではない。

本稿では、SE-FRETとAB-FRETの両方の技術の実装における成功事例を共有し、植物細胞におけるOTLD1とLSH10の相互作用を調査するための展開のプロトコルを紹介します。

Protocol

ニコチアナベンサミアナ、 アグロバクテリウムツメファシエンス 株EHA105、またはGV3101を本研究に使用しました。 1. FRETベクトル構築 ドナー/アクセプターFRETペアの蛍光タグを選択します。pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28(材料表参照)からのEGFPを使用して、ドナーベクターを生成します?…

Representative Results

図2 は、細胞核を3つのチャネル(すなわち、ドナーGFP、アクセプターmRFP、およびSE-FRET)に同時に記録したSE-FRET実験の典型的な結果を示しています。これらのデータは、擬似カラースケールでコード化されたSE-FRET効率の画像を生成するために使用されました。このスケールでは、青から赤への移行は、0%から100%へのタンパク質間近接性の尺度であるFRET効率の増加に対応し…

Discussion

このFRETプロトコルはシンプルで再現が簡単です。また、最小限の供給投資を必要とし、多くの近代的な研究所で標準装置を利用しています。具体的には、5つの主要な技術的特徴がこの手順の多様性を区別します。まず、FRETコンストラクトは、従来の制限酵素ベースのクローニングと比較して使いやすく、正確な結果を生成し、時間を節約するクローニングアプローチである部位特異的組換?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VCの研究室での作業は、NIH(R35GM144059およびR01GM50224)、NSF(MCB1913165およびIOS1758046)、およびBARD(IS-5276-20)からVCへの助成金によってサポートされています。

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Biologie moléculaire. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S., Hartley, D. A. . Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. , 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

Keywords: FRETProtein-protein InteractionAgroinfiltrationNicotiana BenthamianaHistone Modifying EnzymesTranscription FactorsLiving CellFluorescence Resonance Energy Transfer
check_url/fr/64656?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image