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Biologie

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

Abstract

유전자 발현의 후성유전학적 조절은 일반적으로 전사 억제 또는 활성화를 위해 각각 이색성 또는 진색소 히스톤 마크를 생성하는 히스톤 변형 효소(HME)의 영향을 받습니다. HME는 전사 인자(TF)에 의해 표적 염색질에 모집됩니다. 따라서 HME와 TF 간의 직접적인 상호 작용을 감지하고 특성화하는 것은 기능과 특이성을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 이러한 연구는 생체 조직 내에서 생체 내에서 수행되는 경우 생물학적으로 더 관련이 있습니다. 여기에서는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 사용하여 식물 히스톤 데비 퀴티 나제와 식물 전사 인자 사이의 식물 잎에서의 상호 작용을 시각화하기위한 프로토콜이 설명되며,이를 통해 서로 <10nm 이내에있는 단백질 분자 간의 복합체를 검출 할 수 있습니다. FRET 기술의 두 가지 변형이 제시됩니다 : SE-FRET(감작 방출) 및 AB-FRET(수용체 표백), 여기서 에너지는 공여체에서 수용체로 비방사성으로 전달되거나 수용체의 광표백시 공여체에 의해 방사적으로 방출됩니다. SE-FRET와 AB-FRET 접근법 모두 플란타의 다른 단백질 간의 다른 상호 작용을 발견하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

Introduction

식물 히스톤 데유비퀴티나제는 히스톤의 번역 후 변형에 의해, 특히 이들의 모노유비퀴틸화 마크를 삭제함으로써 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 한다1. 지금까지 OTLD1은 애기장대 2,3에서 분자 수준에서 특징 지어지는 몇 안되는 식물 히스톤 데비 키티 나제 중 하나입니다. OTLD1은 H2B 히스톤 분자로부터 모노 유비 퀴틴 그룹을 제거하여 표적 유전자 염색질 4,5에서 H3 히스톤의 유 크로 마틱 아세틸 화 및 메틸화 변형의 제거 또는 첨가를 촉진합니다. 또한, OTLD1은 다른 염색질 변형 효소 인 히스톤 라이신 데 메틸 라제 KDM1C와 상호 작용하여 표적 유전자 6,7의 전사 억제에 영향을 미친다.

대부분의 히스톤 변형 효소는 DNA 결합 능력이 부족하여 표적 유전자를 직접 인식 할 수 없습니다. 한 가지 가능성은 이러한 효소에 결합하여 염색질 표적에 지시하는 DNA 결합 전사 인자 단백질과 협력한다는 것입니다. 구체적으로, 식물에서, 몇몇 주요 히스톤-개질 효소 (즉, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 8,9, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 10, 히스톤 데메틸라제 11, 및 폴리콤 억제 복합체12,13,14)가 전사 인자에 의해 모집되는 것으로 알려져 있다. 이러한 아이디어와 일치하게, 최근에, OTLD1과 전사 인자 LSH1015의 특정 단백질-단백질 상호작용에 기초하는 표적 프로모터로의 OTLD1 모집을 위한 하나의 가능한 메커니즘이 제안되었다.

LSH10은 중앙 발달 조절자 16,17,18,19,20,21,22로 기능하는 식물 ALOG (애기장대 LSH1 및 Oryza G1) 단백질의 계열에 속합니다. ALOG 단백질 패밀리의 구성원이 DNA 결합 모티프(23)를 함유하고, 전사 조절22, 핵 국소화19, 및 동종이량체화(homodimerization)24에 대한 능력을 나타낸다는 사실은 LSH10을 포함하는 이들 단백질이 전사의 후성유전학적 조절 동안 특정 전사 인자로서 작용할 수 있다는 개념을 더욱 뒷받침한다. 생체 내에서 LSH10-OTLD1 상호 작용을 특성화하는 데 사용되는 주요 실험 기술 중 하나는 형광 공명 에너지 전달(FRET)15입니다.

FRET는 살아있는 세포 내에서 서로 <10nm 이내의 단백질25 사이의 근거리 상호 작용을 직접 검출하기위한 이미징 기술입니다. FRET 접근법26에는 감응 방출 (SE-FRET) (도 1A) 및 수용체 표백 (AB-FRET) (도 1B)의 두 가지 주요 변형이 있다. SE-FRET에서, 상호작용 단백질 – 그 중 하나는 공여체 플루오로크롬 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, GFP)으로 태그되고 다른 하나는 수용체 형광 색소 (예를 들어, 단량체성 적색 형광 단백질, mRFP27,28)를 갖는 비-공여체로부터 수용체로 여기 상태 에너지를 전달한다. 이 전송 중에 광자가 방출되지 않기 때문에 수용체와 유사한 복사 방출 스펙트럼을 갖는 형광 신호가 생성됩니다. AB-FRET에서 단백질 상호 작용은 수용체가 광퇴색에 의해 영구적으로 비활성화되어 기증자로부터 전달된 비방사성 에너지를 수신할 수 없을 때 기증자의 상승된 복사 방출을 기반으로 검출되고 정량화됩니다(그림 1). 중요하게도, FRET 형광의 세포내 위치는 세포에서 상호작용하는 단백질의 국소화를 나타낸다.

FRET를 생체 조직에 배치하고 이러한 상호 작용 자체를 감지하는 동시에 상호 작용하는 단백질의 세포 내 위치를 결정할 수 있는 능력은 FRET를 생체 내 단백질-단백질 상호 작용의 연구 및 초기 특성화에 선택하는 기술로 만듭니다. 유사한 생체내 형광 이미징 방법론인 이분자 형광 보완(BiFC)29,30,31,32가 좋은 대안적 접근법이지만, FRET와는 달리, BiFC는 자가형광 BiFC 리포터(33)의 자발적 조립으로 인해 위양성을 생성할 수 있고, 그 데이터의 정량화는 덜 정확하다.

이 기사에서는 SE-FRET와 AB-FRET 기술을 모두 구현한 성공적인 경험을 공유하고 식물 세포에서 OTLD1과 LSH10 간의 상호 작용을 조사하기 위한 배포 프로토콜을 제시합니다.

Protocol

본 연구에는 니코티아나 벤타미아나, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105 또는 GV3101이 사용되었다. 1. FRET 벡터 구성 기증자/수용체 FRET 쌍에 대한 형광 태그를 선택합니다.pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (재료 표 참조)의 EGFP를 사용하여 공여체 벡터를 생성합니다. pPZP-RCS2A-DEST…

Representative Results

도 2 는 세포핵이 3개의 채널(즉, 공여자 GFP, 수용체 mRFP, 및 SE-FRET)에서 동시에 기록된 SE-FRET 실험의 전형적인 결과를 도시한다. 이러한 데이터는 의사 색상 스케일로 코딩된 SE-FRET 효율의 이미지를 생성하는 데 사용되었습니다. 이 척도에서 파란색에서 빨간색으로의 전환은 0%에서 100%까지의 단백질-단백질 근접성을 측정하는 FRET 효율의 증가에 해당합니다. 본 대표적인 실험?…

Discussion

이 FRET 프로토콜은 간단하고 재현하기 쉽습니다. 또한 최소한의 공급 투자가 필요하며 많은 현대 실험실에 표준 장비를 사용합니다. 특히, 다섯 가지 주요 기술적 특징이이 절차의 다양성을 구별합니다. 첫째, FRET 구축물은 기존의 제한 효소 기반 클로닝에 비해 사용하기 쉽고 정확한 결과를 생성하며 시간을 절약하는 클로닝 접근 방식인 부위 특이적 재조합을 사용하여 생성됩니다. 둘째, N. ben…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

V.C. 실험실에서의 작업은 NIH (R35GM144059 및 R01GM50224), NSF (MCB1913165 및 IOS1758046) 및 BARD (IS-5276-20)의 보조금으로 지원됩니다.

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
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References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Biologie moléculaire. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S., Hartley, D. A. . Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. , 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

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Keywords: FRETProtein-protein InteractionAgroinfiltrationNicotiana BenthamianaHistone Modifying EnzymesTranscription FactorsLiving CellFluorescence Resonance Energy Transfer
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Citer Cet Article
Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
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