De klinische microfluïdische chip is een belangrijke biomedische analysetechniek die de voorbewerking van bloedmonsters van klinische patiënten vereenvoudigt en immunofluorescentiekleurig circulerende tumorcellen (CTC’s) in situ op de chip kleurt, waardoor een snelle detectie en identificatie van een enkele CTC mogelijk is.
Circulerende tumorcellen (CTC’s) zijn belangrijk in de prognose, diagnose en antikankertherapie. CTC-inventarisatie is van vitaal belang bij het bepalen van de ziekte van de patiënt, omdat CTC’s zeldzaam en heterogeen zijn. CTC’s worden losgemaakt van de primaire tumor, komen in het bloedcirculatiesysteem en groeien mogelijk op verre plaatsen, waardoor de tumor wordt uitgezaaid. Aangezien CTC’s vergelijkbare informatie bevatten als de primaire tumor, kunnen CTC-isolatie en daaropvolgende karakterisering van cruciaal belang zijn bij het monitoren en diagnosticeren van kanker. De opsomming, affiniteitsmodificatie en klinische immunofluorescentiekleuring van zeldzame CTC’s zijn krachtige methoden voor CTC-isolatie omdat ze de noodzakelijke elementen met een hoge gevoeligheid bieden. Microfluïdische chips bieden een vloeibare biopsiemethode die vrij is van pijn voor de patiënten. In dit werk presenteren we een lijst met protocollen voor klinische microfluïdische chips, een veelzijdig CTC-isolatieplatform, dat een reeks functionaliteiten en diensten bevat die nodig zijn voor CTC-scheiding, analyse en vroege diagnose, waardoor biomoleculaire analyse en kankerbehandeling worden vergemakkelijkt. Het programma omvat het tellen van zeldzame tumorcellen, klinische bloedvoorbewerking van patiënten, waaronder rode bloedcellyse, en de isolatie en herkenning van CTC’s in situ op microfluïdische chips. Het programma maakt de precieze inventarisatie van tumorcellen of CTC’s mogelijk. Daarnaast bevat het programma een tool die CTC-isolatie bevat met veelzijdige microfluïdische chips en immunofluorescentie-identificatie in situ op de chips, gevolgd door biomoleculaire analyse.
Circulerende tumorcellen (CTC’s) zijn belangrijk in de prognose, diagnose en antikankertherapie. CTC-inventarisatie is van vitaal belang omdat CTC’s zeldzaam en heterogeen zijn. De opsomming, affiniteitsmodificatie en klinische immunofluorescentiekleuring van zeldzame CTC’s zijn krachtige technieken voor CTC-isolatie omdat ze de nodige elementen met een hoge gevoeligheid bieden1. Zeldzaam aantal tumorcellen gemengd met normaal bloed bootst echt patiëntenbloed nauw na, omdat 2-3 ml echt patiëntenbloed slechts 1-10 CTC’s bevat. Om een kritisch experimenteel probleem op te lossen, in plaats van een groot aantal tumorcellen te gebruiken die in PBS zijn geïntroduceerd of gemengd met normaal bloed, biedt het gebruik van een zeldzaam aantal tumorcellen ons een laag aantal bloedcellen, wat dichter bij de realiteit ligt bij het uitvoeren van een experiment.
Kanker is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld2. CTC’s zijn tumorcellen die worden afgestoten van de oorspronkelijke tumor en die circuleren in het bloed en lymfecirculatiesystemen3. Wanneer CTC’s naar een nieuwe overlevingsomgeving verhuizen, groeien ze als een tweede tumor. Dit wordt metastase genoemd en is verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen bij kankerpatiënten4. CTC’s zijn van vitaal belang voor de prognose, vroege diagnose en voor het begrijpen van de mechanismen van kanker. CTC’s zijn echter uiterst zeldzaam en heterogeen in het bloed van de patiënt 5,6.
Microfluïdische chips bieden een vloeibare biopsie die de tumor niet binnendringt. Ze hebben het voordeel dat ze draagbaar zijn, goedkoop zijn en een op cellen afgestemde schaal hebben. De isolatie van CTC’s met microfluïdische chips wordt voornamelijk ingedeeld in twee soorten: affiniteitsgebaseerd, dat afhankelijk is van antigeen-antilichaambinding 7,8,9 en de oorspronkelijke en meest gebruikte methode van CTC-isolatie is; en fysieke chips, die gebruik maken van grootte- en vervormbaarheidsverschillen tussen tumorcellen en bloedcellen 10,11,12,13,14,15, zijn labelvrij en eenvoudig te bedienen. Het voordeel van microfluïdische chips ten opzichte van alternatieve technieken is dat de fysische benadering van big-ellips microfilters CTC’s stevig vangt met een hoge opname-efficiëntie. De reden hiervoor is dat ellipsmicroposten zijn georganiseerd in slanke tunnels van lijnspleten. De lijnspleten verschillen van de traditionele puntpuntspleten gevormd door microposten zoals ruitmicroposten. Wave-chip-gebaseerde opname van CTC’s combineert zowel fysieke eigenschapsgebaseerde als affiniteitsgebaseerde isolatie. Golfchip-gebaseerde opname omvat 30 golfvormige arrays met het antilichaam van anti-EpCAM gecoat op cirkelvormige microposts. De CTC’s worden opgevangen door de kleine openingen en de grote openingen worden gebruikt om het debiet te versnellen. De gemiste CTC’s moeten de kleine openingen in de volgende array passeren en worden opgevangen door de op affiniteit gebaseerde isolatie die in de chip16 is geïntegreerd.
Het doel van het protocol is om het tellen van zeldzame aantallen tumorcellen en de klinische analyse van CTC’s met microfluïdische chips aan te tonen. Het protocol beschrijft de CTC-isolatiestappen, hoe een laag aantal tumorcellen te verkrijgen, de klinische fysieke scheiding van kleine ellipsfilters, grote-ellipsfilters en trapeziumfilters, affiniteitsmodificatie en verrijking17.
De prognose en vroege diagnose van kanker hebben een significant effect op de behandeling van kanker1. CTC-isolatie met microfluïdische chips biedt een vloeibare biopsie zonder invasie. CTC’s zijn echter uiterst zeldzaam en heterogeen in het bloed1, wat het een uitdaging maakt om CTC’s te isoleren. CTC’s hebben vergelijkbare eigenschappen als de oorspronkelijke tumorbronnen waaruit ze afkomstig zijn. CTC’s spelen dus een vitale rol bij kankermetastase1</s…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), de National Natural Science Foundation of China (21904003), het Scientific Research Project van Tianjin Education Commission (2018KJ154), het Provincial Natural Science Research Program of Higher Education Institutions of Anhui Province (KJ2020A0239) en het Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Verwerking, East China Normal University (MIP20221).
Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |