Klinische Mikrofluidik-Chip-Plattform zur Isolierung vielseitig zirkulierender Tumorzellen

Summary

Der klinische Mikrofluidik-Chip ist eine wichtige biomedizinische Analysetechnik, die die Vorverarbeitung klinischer Patientenblutproben vereinfacht und zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in situ auf dem Chip immunfluoreszent färbt, was den schnellen Nachweis und die Identifizierung eines einzelnen CTC ermöglicht.

Abstract

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind für die Krebsprognose, -diagnose und -therapie von Bedeutung. Die CTC-Zählung ist für die Bestimmung der Patientenerkrankung von entscheidender Bedeutung, da CTCs selten und heterogen sind. CTCs lösen sich vom Primärtumor, gelangen in den Blutkreislauf und wachsen möglicherweise an entfernten Stellen, wodurch der Tumor metastasiert wird. Da CTCs ähnliche Informationen wie der Primärtumor enthalten, kann die CTC-Isolierung und die anschließende Charakterisierung bei der Überwachung und Diagnose von Krebs von entscheidender Bedeutung sein. Die Enumeration, Affinitätsmodifikation und klinische Immunfluoreszenzfärbung seltener CTCs sind leistungsfähige Methoden für die CTC-Isolierung, da sie die notwendigen Elemente mit hoher Sensitivität liefern. Mikrofluidische Chips bieten eine Flüssigbiopsiemethode, die für die Patienten schmerzfrei ist. In dieser Arbeit stellen wir eine Liste von Protokollen für klinische mikrofluidische Chips vor, eine vielseitige CTC-Isolierungsplattform, die eine Reihe von Funktionalitäten und Diensten enthält, die für die CTC-Trennung, -Analyse und -Frühdiagnose erforderlich sind, und so die biomolekulare Analyse und Krebsbehandlung erleichtern. Das Programm umfasst die Zählung seltener Tumorzellen, die klinische Vorverarbeitung des Patientenblutes, einschließlich der Lyse roter Blutkörperchen, sowie die Isolierung und Erkennung von CTCs in situ auf mikrofluidischen Chips. Das Programm ermöglicht die präzise Zählung von Tumorzellen oder CTCs. Darüber hinaus enthält das Programm ein Tool, das die CTC-Isolierung mit vielseitigen mikrofluidischen Chips und die Immunfluoreszenzidentifikation in situ auf den Chips umfasst, gefolgt von einer biomolekularen Analyse.

Introduction

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind für die Krebsprognose, -diagnose und -therapie von Bedeutung. Die CTC-Zählung ist von entscheidender Bedeutung, da CTCs selten und heterogen sind. Die Enumeration, Affinitätsmodifikation und klinische Immunfluoreszenzfärbung seltener CTCs sind leistungsfähige Techniken für die CTC-Isolierung, da sie die notwendigen Elemente mit hoher Sensitivität bieten¹. Die seltene Anzahl von Tumorzellen, die mit normalem Blut vermischt sind, ahmt echtes Patientenblut sehr gut nach, da 2-3 ml echtes Patientenblut nur 1-10 CTCs enthalten. Um ein kritisches experimentelles Problem zu lösen, anstatt eine große Anzahl von Tumorzellen zu verwenden, die in PBS eingeführt oder mit normalem Blut vermischt wurden, liefert uns die Verwendung einer seltenen Anzahl von Tumorzellen eine geringe Anzahl von Blutzellen, was bei der Durchführung eines Experiments näher an der Realität ist.

Krebs ist die häufigste Todesursache weltweit². CTCs sind Tumorzellen, die vom ursprünglichen Tumor abgestoßen werden und im Blut- und Lymphkreislauf zirkulieren³. Wenn sich CTCs in eine neue überlebensfähige Umgebung bewegen, wachsen sie wie ein zweiter Tumor. Dies wird als Metastasierung bezeichnet und ist für 90 % der Todesfälle bei Krebspatienten verantwortlich⁴. CTCs sind entscheidend für die Prognose, die Frühdiagnose und das Verständnis der Mechanismen von Krebs. CTCs sind jedoch extrem selten und heterogen^{im Blut der} Patienten ^5,6.

Mikrofluidische Chips bieten eine flüssige Biopsie, die nicht in den Tumor eindringt. Sie haben den Vorteil, dass sie tragbar und kostengünstig sind und über eine auf die Zellen abgestimmte Waage verfügen. Die Isolierung von CTCs mit mikrofluidischen Chips wird hauptsächlich in zwei Arten eingeteilt: affinitätsbasiert, die auf der Antigen-Antikörper-Bindung beruht ^7,8,9 und die ursprüngliche und am weitesten verbreitete Methode der CTC-Isolierung ist; und physikalische Chips, die Größen- und Verformbarkeitsunterschiede zwischen Tumorzellen und Blutzellen 10,11,12,13,14,15 nutzen^, sind markierungsfrei und einfach zu bedienen. Der Vorteil von Mikrofluidik-Chips gegenüber alternativen Techniken besteht darin, dass der physikalisch basierte Ansatz von Mikrofiltern mit großen Ellipsen CTCs mit hoher Abscheideeffizienz fest einfängt. Der Grund dafür ist, dass Ellipsen-Mikropfosten in schmalen Tunneln mit Linien-Linien-Lücken organisiert sind. Die Linien-Linien-Lücken unterscheiden sich von den herkömmlichen Punkt-Punkt-Lücken, die von Mikropfosten wie Rauten-Mikropfosten gebildet werden. Die Wellenchip-basierte Erfassung von CTCs kombiniert sowohl eine auf physikalischen Eigenschaften basierende als auch eine affinitätsbasierte Isolierung. Der Wellenchip-basierte Einfang umfasst 30 wellenförmige Arrays, bei denen der Antikörper von Anti-EpCAM auf kreisförmigen Mikropfosten beschichtet ist. Die CTCs werden von den kleinen Lücken erfasst, und die großen Lücken werden genutzt, um die Durchflussrate zu beschleunigen. Die verpassten CTCs müssen die kleinen Lücken im nächsten Array passieren und werden von der affinitätsbasierten Isolierung erfasst, die in den Chip¹⁶ integriert ist.

Ziel des Protokolls ist es, die Zählung seltener Tumorzellen und die klinische Analyse von CTCs mit mikrofluidischen Chips zu demonstrieren. Das Protokoll beschreibt die CTC-Isolierungsschritte, die Gewinnung einer geringen Anzahl von Tumorzellen, die klinisch-physikalische Trennung von Small-Ellipse-Filtern, Big-Ellipse-Filtern und Trapezfiltern, die Affinitätsmodifikation und die Anreicherung¹⁷.

Protocol

Die Blutproben der Patienten wurden vom Longhua Hospital geliefert, das der Shanghai Medical University angegliedert ist.Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung des Dritten Krankenhauses der Universität Peking. Die Patienten erhielten eine Einverständniserklärung für die Verwendung der Proben zu Forschungszwecken. 1. Pre-Experiment zur Überprüfung der Einfangeffizienz mit kultivierten Tumorzellen Kultivierung der Tumorzellen …

Representative Results

Das gesamte Setup besteht aus einer Spritzenpumpe, einer Spritze und einem Mikrofluidik-Chip. Die Zellsuspension in der Spritze wird mit der Spritzenpumpe verbunden, und die Zellsuspension wird in den Mikrofluidik-Chip eingeführt, um die Zellen einzufangen. Die Erfassungseffizienz für alle verwendeten Mikrofluidik-Chips lag bei etwa 90 % oder mehr. Für den Wellenchip haben wir Mikrostrukturen mit unterschiedlichen Lücken entworfen. Die kleinen Lücken werden verwendet, um die CTCs zu erfassen, und die großen Lücken…

Discussion

Die Prognose und Früherkennung von Krebserkrankungen haben einen signifikanten Einfluss auf die Krebsbehandlung¹. Die CTC-Isolierung mit mikrofluidischen Chips ermöglicht eine Flüssigbiopsie ohne Invasion. CTCs sind jedoch extrem selten und heterogen im Blut¹, was die Isolierung von CTCs erschwert. CTCs haben ähnliche Eigenschaften wie die ursprünglichen Tumorquellen, aus denen sie stammen. Somit spielen CTCs eine wichtige Rolle bei der Krebsmetastasierung<sup class="x…

Materials

Calcein AM	BIOTIUM	80011
calibrated microcapillary pipettes	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratin monoclonal antibody
DMEM	HyClone	SH30081.05
fetal bovine serum (FBS)	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., China	C0031
penicillin-streptomycin	Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL)	Solarbio, Beijing	R1010