3D Organoidlerde Oral-Özofagus Skuamöz Hücreli Karsinomun Modellenmesi
Summary
Bu protokol, kimyasal karsinogenez yoluyla indüklenen normal, preneoplastik ve skuamöz hücreli karsinom lezyonlarını temsil eden murin oral-özofagus 3D organoidlerini üretmek ve karakterize etmek için anahtar adımları açıklamaktadır.
Abstract
Özofagus skuamöz hücreli karsinomu (ESCC) dünya çapında yaygındır ve her yıl tüm özofagus kanseri vakalarının% 90’ını oluşturur ve tüm insan skuamöz hücreli karsinomlarının en ölümcül olanıdır. ESKİT başlangıcı ve gelişimine eşlik eden moleküler değişikliklerin tanımlanmasındaki son gelişmelere rağmen, hasta prognozu kötüdür. Bu moleküler değişikliklerin işlevsel ek açıklaması gerekli bir sonraki adımdır ve hem ESCC’nin moleküler özelliklerini yakalayan hem de işlevsel ek açıklama için kolayca ve ucuz bir şekilde manipüle edilebilen modeller gerektirir. Tütün dumanı mimetik 4-nitrokinolin 1-oksit (4NQO) ile tedavi edilen fareler öngörülebilir şekilde ESCC ve özofagus preneoplazisi oluşturur. Not olarak, 4NQO lezyonları ayrıca ağız boşluğunda, en yaygın olarak dilde ve ayrıca tabakalı skuamöz epiteli paylaşan ön midede ortaya çıkar. Bununla birlikte, bu fareler fonksiyonel hipotez testi için basitçe manipüle edilemez, çünkü izojenik fare modelleri üretmek zaman ve kaynak yoğundur. Burada, murin ESCC veya preneoplastik hücreleri ex vivo olarak karakterize etmek için 4NQO ile muamele edilmiş farelerden tek hücreli türetilmiş üç boyutlu (3D) organoidler üreterek bu sınırlamanın üstesinden geliyoruz. Bu organoidler, ESCC ve özofagus preneoplazisinin göze çarpan özelliklerini yakalar, izojenik modeller oluşturmak için ucuz ve hızlı bir şekilde kullanılabilir ve sinjenik transplantasyon deneyleri için kullanılabilir. Normal, preneoplastik ve SCC murin özofagus dokusundan 3D organoidlerin nasıl üretileceğini ve bu organoidlerin nasıl korunacağını ve kriyoproteksiyonunu gösteriyoruz. Bu çok yönlü organoidlerin uygulamaları geniştir ve genetiği değiştirilmiş farelerin kullanımını ve akış sitometrisi veya immünohistokimya ile daha fazla karakterizasyonu, CRISPR teknolojilerini kullanarak izojenik organoid hatlarının oluşturulmasını ve ilaç taramasını veya sinjenik transplantasyonu içerir. Bu protokolde gösterilen tekniklerin yaygın olarak benimsenmesinin, ESCC’nin ağır yüküyle mücadele etmek için bu alandaki ilerlemeyi hızlandıracağına inanıyoruz.
Introduction
Özofagus skuamöz hücreli karsinomu (ESKK), geç tanısı, tedaviye direnci ve metastazı nedeniyle insan skuamöz hücreli karsinomlarının en ölümcül olanıdır 1,2. ESCC, yemek borusunun luminal yüzeyini kaplayan tabakalı skuamöz epitelden kaynaklanır. Skuamöz epitel, proliferatif bazal hücrelerden ve suprabazal hücre tabakasındaki farklılaşmış hücrelerden oluşur. Fizyolojik koşullar altında, bazal hücreler p63, Sox2 ve sitokeratin K5 ve K14 gibi belirteçleri eksprese ederken, farklılaşmış hücreler K4, K13 ve IVL’yi eksprese eder. Bazal hücrelerin kendileri heterojendir ve K153 ve CD734 gibi belirteçlerle tanımlanan varsayılan kök hücreleri içerir. Homeostazda, bazal hücreler suprabazal hücre tabakası içinde post-mitotik terminal farklılaşmasına uğrarken, farklılaşmış hücreler epitel yenilenmesini tamamlamak için lümene göç eder ve deskuamat eder. Menşe hücrelerini anımsatan ESCC, değişen derecelerde skuamöz hücre farklılaşması gösterir. ESCC sıklıkla intraepitelyal neoplazi (IEN) veya displazi olarak bilinen ve atipik bazaloid hücrelerden oluşan multifokal histolojik öncül lezyonlar eşlik eder. Epitel değişikliklerine ek olarak, ESCC, kanserle ilişkili fibroblastların (CAF’ler) aktivasyonunun ve tümörü teşvik eden mikro çevreyi teşvik etmek için bağışıklık / enflamatuar hücrelerin işe alınmasının gerçekleştiği subepitel bölmesinde doku yeniden şekillenmesini gösterir.
ESCC’nin patogenezi genetik değişiklikleri ve çevresel risk faktörlerine maruz kalmayı içerir. Anahtar genetik lezyonlar arasında tümör baskılayıcı genler TP53 ve CDKN2A’nın (p16INK4A) inaktivasyonu ve CCND1 (siklin D1) ve EGFR onkogenlerinin aktivasyonu yer alır ve bunlar bozulmuş hücre döngüsü kontrol noktası fonksiyonu, anormal proliferasyon ve çevresel kanserojenlere maruz kalmaya bağlı genotoksik stres altında sağkalım ile sonuçlanır. Gerçekten de, genetik değişiklikler davranışsal ve çevresel risk faktörleriyle, en yaygın olarak tütün ve alkol kullanımıyla yakından etkileşime girer. Tütün dumanı, aynı zamanda alkolün ana metaboliti olan asetaldehit gibi insan kanserojenleri içerir. Asetaldehit, DNA adduktlarını ve interstrand DNA çapraz bağlarını indükleyerek DNA hasarına ve DNA mutasyonlarının birikmesine ve kromozomal instabiliteye yol açar. Aşırı mitojenik uyaranlar ve onkogen aktivasyonundan kaynaklanan anormal proliferasyon göz önüne alındığında, özofagus epitel hücrelerinin malign transformasyonu, antioksidanların aktivasyonu, otofaji ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) dahil olmak üzere genotoksik stresle başa çıkma mekanizmaları ile kolaylaştırılmıştır. İlginçtir ki, bu sitoprotektif fonksiyonlar sıklıkla yüksek CD44 (CD44H) ekspresyonu ile karakterize edilen ve tümör başlatma, invazyon, metastaz ve tedavi direnci yeteneklerine sahip ESCC kanser kök hücrelerinde (CSC’ler) aktive edilir 5,6,7.
ESCC, hücre kültüründe ve kemirgen modellerindemodellenmiştir 8,9. Son otuz yılda, ESCC’nin sağlam genetik olarak tasarlanmış fare modelleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında CCND1 ve EGFR transgenik fareler 10,11 ve p53 ve p120Ctn nakavt fareleri 12,13 bulunur. Bununla birlikte, tek genetik değişiklikler tipik olarak hızlı başlangıçlı ESCC ile sonuçlanmaz. Bu zorluk, ESCC14’teki insan genetik lezyonlarını iyi özetleyen özofagus kanserojenlerin kullanımı ile aşılmıştır. Örneğin, 4-nitrokinolin-1-oksit (4NQO), CCND1 transgenik farelerde ESCC gelişimini hızlandırır15. Son yıllarda, varsayılan özofagus epitel kök hücreleri, progenitör hücreler ve bunların kaderleri, hücre soyundan izlenebilir fare modellerinde araştırılmıştır 3,4. Ayrıca, bu hücre soyu izlenebilir fareler, ESCC’nin menşe hücrelerini ve bu hücrelerin geleneksel histoloji ve omik tabanlı molekülerkarakterizasyon 7 yoluyla CD44H CSC’lere nasıl yol açtığını araştırmak için kullanılmıştır.
Bu fare modelleriyle ilgili ortaya çıkan bir alan, orijinal dokuların mimarisinin ex vivo 7,8,9 olarak özetlendiği üç boyutlu (3D) bir organoid sistemde canlı ESCC ve öncü hücreleri analiz etmek için hücre kültürü tekniklerinin yeni uygulamasıdır. Bu 3D organoidler, primer ve metastatik tümörler (örneğin, lenf nodu, akciğer ve karaciğer lezyonları) dahil olmak üzere murin dokularından izole edilen tek hücreli bir süspansiyondan hızla büyür. Hücreler bazal membran ekstraktına (BME) gömülür ve iyi tanımlanmış serumsuz bir hücre kültürü ortamı ile beslenir. 3D organoidler 7-10 gün içinde büyür ve ortaya çıkan küresel yapılar, CSC belirteçleri, EMT, otofaji, proliferasyon, farklılaşma ve apoptotik hücre ölümü dahil olmak üzere çeşitli hücresel özellikleri ve fonksiyonları analiz etmek için alt kültür, kriyoprezervasyon ve tahliller için uygundur.
Bu yöntemler, baş ve boyun mukozası (ağız boşluğu, dil, farenks ve gırtlak) ve hatta ön mide gibi herhangi bir tabakalı skuamöz epitel dokusundan oluşturulan 3D organoid kültürlere geniş çapta uygulanabilir. Baş ve boyun mukozası yemek borusu ile bitişiktir ve iki doku benzer doku organizasyonunu, işlevini ve hastalığa duyarlılığını paylaşır. Hem baş hem boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) hem de ESCC, genetik lezyonları ve tütün ve alkol maruziyeti gibi yaşam tarzıyla ilgili çevresel risk faktörlerini paylaşır. Bu benzerliğin altını çizerek, tütün dumanı mimetik 4NQO ile tedavi edilen fareler hem HNSCC hem de ESCC’yi kolayca geliştirir. Aşağıda açıklanan protokollerin HNSCC’nin modellenmesinde uygulanabilmesinin kolaylığı göz önüne alındığında, bu lezyonlardan 3D organoid kültürlerin oluşturulması için özel talimatlar içermektedir.
Burada, 4NQO ile tedavi edilen farelerde gelişen normal, preneoplastik ve ESCC lezyonlarını temsil eden murin özofagus 3D organoidleri (MEO’lar) üretmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. C57BL/6 gibi yaygın laboratuvar suşları ve hücre soyu izlenebilir ve diğer genetiği değiştirilmiş türevleri de dahil olmak üzere çeşitli fare suşları kullanılabilir. Normal veya hastalıklı murin özofagus epitelinin izolasyonu, tek hücreli süspansiyonların hazırlanması, büyüyen 3D organoidlerin yetiştirilmesi ve izlenmesi, alt kültür, kriyoprezervasyon ve morfoloji ve diğer uygulamalar dahil olmak üzere sonraki analizler için işleme dahil olmak üzere kilit adımları vurguluyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokollerde MEO’ların oluşturulması ve analizi için birkaç kritik adım ve husus vardır. MEO deneylerinde tekrarlanabilirliği ve titizliği sağlamak için, biyolojik ve teknik kopyaların her ikisi de önemlidir. Biyolojik replikalar için, ESCC taşıyan iki ila üç bağımsız fare genellikle deneysel koşul başına yeterlidir. Bununla birlikte, uygun biyolojik replika sayısı, bireysel çalışmalarda test edilecek parametrelere bağlı olarak değişebilir. Örneğin, makroskopik olara…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik destek için Columbia Üniversitesi’ndeki Herbert Irving Kapsamlı Kanser Merkezi’ndeki Ortak Kaynaklara (Akış Sitometrisi, Moleküler Patoloji ve Konfokal ve Özel Mikroskopi) teşekkür ederiz. Dr. Alan Diehl, Adam J. Bass ve Kwok-Kin Wong’a (NCI P01 Özofagus Karsinogenezinin Mekanizmaları) ve Rustgi ve Nakagawa laboratuvarlarının üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki NIH Hibeleri ile desteklenmiştir: P01CA098101 (H.N. ve A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. ve H.N.) ve P30CA013696 (AKR.) H.N. ve C.L., Columbia Üniversitesi Herbert Irving Kapsamlı Kanser Merkezi Multi-PI Pilot Ödülü’nü aldı. H.N., Fanconi Anemi Araştırma Fonu Ödülü’nün sahibidir. F.M.H., Mark Vakfı Kanser Araştırma Ödülü (20-60-51-MOME) ve Amerikan Kanser Araştırmaları Derneği Ödülü’nün sahibidir. J.G., Amerikan Gastroenteroloji Derneği (AGA) ödülünün sahibidir.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Recherche en cancérologie. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
