מידול קרצינומה של תאי קשקש אוראליים-ושטיים באורגנואידים תלת-ממדיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים ליצירה ולאפיון אורגנואידים תלת-ממדיים אוראליים-ושטיים המייצגים נגעים נורמליים, פרה-נאופלסטיים ונגעי קרצינומה של תאי קשקש הנגרמים באמצעות קרצינוגנזה כימית.
Abstract
קרצינומה של תאי קשקש בוושט (ESCC) נפוצה ברחבי העולם, ומהווה 90% מכלל מקרי סרטן הוושט מדי שנה, והיא הקטלנית ביותר מבין כל קרצינומות תאי הקשקש האנושיים. למרות ההתקדמות האחרונה בהגדרת השינויים המולקולריים המלווים את ההתחלה וההתפתחות של ESCC, הפרוגנוזה של המטופלים נותרה גרועה. הביאור הפונקציונלי של שינויים מולקולריים אלה הוא השלב הבא ההכרחי ודורש מודלים שגם לוכדים את התכונות המולקולריות של ESCC וגם ניתנים למניפולציה בקלות ובזול לביאור פונקציונלי. עכברים שטופלו בעשן טבק מחקה תחמוצת 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) באופן צפוי יוצרים ESCC ופרנאופלזיה של הוושט. יש לציין כי נגעים 4NQO מתעוררים גם בחלל הפה, לרוב בלשון, כמו גם בקדמת הבטן, אשר כולם חולקים את אפיתל הקשקש המרובד. עם זאת, לא ניתן פשוט לתמרן עכברים אלה לבדיקת השערות פונקציונליות, מכיוון שיצירת מודלים של עכברים איזוגניים דורשת זמן ומשאבים. כאן, אנו מתגברים על מגבלה זו על ידי יצירת אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בתא יחיד מעכברים שטופלו ב-4NQO כדי לאפיין תאי ESCC (ESCC) או תאים פרה-נאופלסטיים ex vivo. אורגנואידים אלה לוכדים את התכונות הבולטות של ESCC ופרנאופלזיה של הוושט, ניתן למנף אותם בזול ובמהירות ליצירת מודלים איזוגניים, וניתן להשתמש בהם לניסויי השתלה סינגניים. אנו מדגימים כיצד ליצור אורגנואידים תלת-ממדיים מרקמת ושט רגילה, פרנאופלסטית ו-SCC מורין ולתחזק ולשמר בהקפאה אורגנואידים אלה. היישומים של אורגנואידים מגוונים אלה הם רחבים וכוללים שימוש בעכברים מהונדסים גנטית ואפיון נוסף על ידי ציטומטריית זרימה או אימונוהיסטוכימיה, יצירת קווי אורגנואידים איזוגניים באמצעות טכנולוגיות CRISPR, וסינון תרופות או השתלות סינגניות. אנו מאמינים כי האימוץ הנרחב של הטכניקות המוצגות בפרוטוקול זה יאיץ את ההתקדמות בתחום זה כדי להילחם בנטל החמור של ESCC.
Introduction
קרצינומה של תאי קשקש בוושט (ESCC) היא הקטלנית ביותר מבין קרצינומות תאי הקשקש האנושיים, בשל האבחנה המאוחרת שלה, עמידות לטיפול וגרורות 1,2. ESCC נובע מאפיתל קשקשי מרובד, אשר מצפה את פני השטח הלומינליים של הוושט. אפיתל הקשקש מורכב מתאי בסיס מתרבים ותאים ממוינים בתוך שכבת התא העל-בסיסי. בתנאים פיזיולוגיים, תאי בסיס מבטאים סמנים כגון p63, Sox2 וציטוקרטין K5 ו-K14, בעוד שתאים ממוינים מבטאים K4, K13 ו-IVL. תאי הבסיס עצמם הם הטרוגניים וכוללים תאי גזע משוערים המוגדרים על ידי סמנים כגון K153 ו- CD734. בהומאוסטזיס, תאי הבסיס עוברים התמיינות טרמינלית פוסט-מיטוטית בתוך שכבת התא העל-בסיסית, בעוד שתאים ממוינים נודדים ומתפרקים לתוך הלומן כדי להשלים את חידוש האפיתל. ESCC, המזכיר את תאי המוצא שלהם, מציג התמיינות תאי קשקש בדרגות שונות. ESCC מלווה לעתים קרובות בנגעים מקדימים היסטולוגיים מולטיפוקליים, המכונים ניאופלזיה תוך-אפיתליאלית (IEN) או דיספלזיה, הכוללים תאים בזלואידים לא טיפוסיים. בנוסף לשינויים באפיתל, ESCC מציג עיצוב מחדש של רקמות בתוך התא התת-אפיתליאלי, שם ההפעלה של פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) וגיוס תאים חיסוניים/דלקתיים מתרחשים כדי לטפח את המיקרו-סביבה המקדמת גידולים.
הפתוגנזה של ESCC כרוכה בשינויים גנטיים וחשיפה לגורמי סיכון סביבתיים. נגעים גנטיים עיקריים כוללים את השבתת הגנים מדכאי הגידול TP53 ו– CDKN2A (p16INK4A) והפעלת האונקוגנים CCND1 (ציקלין D1) ו- EGFR, אשר מגיעים לשיאם בתפקוד לקוי של מחסום מחזור התא, התפשטות חריגה והישרדות תחת לחץ גנוטוקסי הקשור לחשיפה לחומרים מסרטנים סביבתיים. ואכן, שינויים גנטיים מקיימים אינטראקציה הדוקה עם גורמי סיכון התנהגותיים וסביבתיים, לרוב שימוש בטבק ובאלכוהול. עשן טבק מכיל חומרים מסרטנים בבני אדם כגון אצטאלדהיד, שהוא גם המטבוליט העיקרי של אלכוהול. אצטאלדהיד גורם לצינורות DNA ולהצלבות DNA בין-גדיליות, מה שמוביל לנזק לדנ”א ולהצטברות מוטציות DNA וחוסר יציבות כרומוזומלית. בהינתן גירויים מיטוגניים מוגזמים והתפשטות חריגה מהפעלת אונקוגנים, הטרנספורמציה הממאירה של תאי אפיתל הוושט מתאפשרת על ידי מנגנונים להתמודדות עם לחץ גנוטוקסי, כולל הפעלת נוגדי חמצון, אוטופגיה ומעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT). באופן מעניין, פונקציות ציטוטופרוטקטיביות אלה מופעלות לעתים קרובות בתאי גזע סרטניים ESCC (CSC) המאופיינים בביטוי CD44 גבוה (CD44H) ויש להם את היכולות של ייזום גידול, פלישה, גרורות ועמידות לטיפול 5,6,7.
ESCC עוצב בתרבית תאים ובמודלים של מכרסמים 8,9. בשלושת העשורים האחרונים פותחו מודלים חזקים של עכברים מהונדסים גנטית של ESCC. אלה כוללים עכברים טרנסגניים CCND1 ו-EGFR 10,11 ועכברי נוקאאוט p53 ו-p120Ctn 12,13. עם זאת, שינויים גנטיים בודדים אינם גורמים בדרך כלל להתפרצות מהירה של ESCC. אתגר זה כבר להתגבר על ידי השימוש של מסרטנים הוושט כי לשחזר היטב את הנגעים הגנטיים האנושיים ESCC14. לדוגמה, 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) מאיץ את התפתחות ESCC בעכברים טרנסגניים CCND1 15. בשנים האחרונות, תאי גזע אפיתליאליים משוערים של הוושט, תאי אב, וגורלם בהתאמה נחקרו במודלים עכבריים 3,4 הניתנים למעקב אחר שושלת תאים. יתר על כן, עכברים אלה שניתן לעקוב אחר שושלת תאים אלה שימשו לחקר תאי המקור של ESCC וכיצד תאים כאלה יוצרים CSCs CD44H באמצעות היסטולוגיה קונבנציונלית ואפיון מולקולרי מבוסס אומיקס7.
תחום מתפתח אחד הקשור למודלים עכבריים אלה הוא היישום החדש של טכניקות תרבית תאים לניתוח תאי ESCC חיים ותאים מקדימים במערכת אורגנואידים תלת-ממדית (3D) שבה הארכיטקטורה של הרקמות המקוריות משוחזרת ex vivo 7,8,9. אורגנואידים תלת-ממדיים אלה גדלים במהירות מתרחיף חד-תאי המבודד מרקמות מורין, כולל גידולים ראשוניים וגרורתיים (למשל, בלוטות לימפה, ריאות ונגעים בכבד). התאים מוטמעים בתמצית קרום מרתף (BME) ומוזנים בתווך תרבית תאים מוגדר היטב ללא סרום. האורגנואידים התלת-ממדיים גדלים תוך 7-10 ימים, והמבנים הכדוריים המתקבלים מתאימים לתת-תרבית, שימור בהקפאה ובדיקות לניתוח מגוון תכונות ותפקודים תאיים, כולל סמני CSC, EMT, אוטופגיה, התפשטות, התמיינות ומוות תאים אפופטוטיים.
שיטות אלה יכולות להיות מיושמות באופן נרחב על תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות שנוצרו מכל רקמת אפיתל קשקשית מרובדת, כגון רירית הראש והצוואר (חלל הפה, הלשון, הלוע והגרון) ואפילו הקיבה הקדמית. רירית הראש והצוואר רציפה עם הוושט, ושתי הרקמות חולקות ארגון רקמות, תפקוד ורגישות דומים למחלות. הן קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC) והן ESCC חולקים נגעים גנטיים וגורמי סיכון סביבתיים הקשורים לאורח חיים, כגון חשיפה לטבק ולאלכוהול. כדי להדגיש את הדמיון הזה, עכברים שטופלו בעשן טבק מחקה 4NQO מפתחים בקלות גם HNSCC וגם ESCC. בהתחשב בקלות שבה ניתן ליישם את הפרוטוקולים המתוארים להלן על מידול HNSCC, אנו כוללים הוראות ספציפיות להקמת תרביות אורגנואידים תלת ממדיות מנגעים אלה.
כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של הוושט (MEOs) המייצגים נגעים נורמליים, פרנאופלסטיים ו-ESCC המתפתחים בעכברים שטופלו ב-4NQO. ניתן להשתמש בזני עכברים שונים, כולל זני מעבדה נפוצים כגון C57BL/6 ומעקב אחר שושלת תאים ונגזרות מהונדסות-גנטית אחרות. אנו מדגישים את שלבי המפתח, כולל בידוד של אפיתל ושט מורין רגיל או חולה, הכנת תרחיפים חד-תאיים, טיפוח וניטור של אורגנואידים תלת-ממדיים גדלים, תת-תרבית, שימור קריוגני ועיבוד לניתוחים הבאים, כולל מורפולוגיה ויישומים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר שלבים ושיקולים קריטיים ליצירה וניתוח של MEOs בפרוטוקולים המתוארים כאן. כדי להבטיח יכולת שחזור וקפדנות בניסויי MEO, שכפולים ביולוגיים וטכניים חשובים שניהם. עבור שכפולים ביולוגיים, שניים עד שלושה עכברים עצמאיים הנושאים ESCC מספיקים בדרך כלל לכל תנאי ניסוי. עם זאת, המספר המתאים של שכפול…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למשאבים המשותפים (ציטומטריית זרימה, פתולוגיה מולקולרית ומיקרוסקופיה קונפוקלית ומיוחדת) במרכז הסרטן המקיף ע”ש הרברט אירווינג באוניברסיטת קולומביה על התמיכה הטכנית. אנו מודים לד”ר אלן דיהל, אדם ג’יי בס וד”ר קווק-קין וונג (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) ולחברי מעבדות Rustgi ו-Nakagawa על דיונים מועילים. מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH הבאים: P01CA098101 (H.N. ו- A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(י.ג.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. ו-H.N.) ו-P30CA013696 (A.K.R). H.N. ו- C.L. זכו בפרס הפיילוט Multi-PI של מרכז הסרטן המקיף ע”ש הרברט אירווינג באוניברסיטת קולומביה. H.N. הוא חתן פרס קרן המחקר פאנקוני אנמיה. פ.מ.ה. זכה בפרס קרן מארק לחקר הסרטן (20-60-51-MOME) ובפרס האגודה האמריקאית לחקר הסרטן. J.G. הוא חתן פרס האגודה הגסטרואנטרולוגית האמריקאית (AGA).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Recherche en cancérologie. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
