Une plateforme microfluidique pour étudier le biocolmatage en milieu poreux

Summary

Le présent protocole décrit une plateforme microfluidique pour étudier le développement de biofilms dans des milieux poreux quasi-2D en combinant l’imagerie microscopique à haute résolution avec des mesures simultanées de différence de pression. La plateforme quantifie l’influence de la taille des pores et des débits de fluide dans les milieux poreux sur le biocolmatage.

Abstract

Les biofilms bactériens se trouvent dans plusieurs milieux poreux environnementaux et industriels, y compris les sols et les membranes de filtration. Les biofilms se développent dans certaines conditions d’écoulement et peuvent obstruer les pores, redirigeant ainsi l’écoulement local du fluide. La capacité des biofilms à obstruer les pores, ce qu’on appelle le biocolmatage, peut avoir un effet considérable sur la perméabilité locale du milieu poreux, créant une accumulation de pression dans le système et ayant un impact sur le flux massique qui le traverse. Pour comprendre l’interaction entre la croissance du biofilm et l’écoulement du fluide dans différentes conditions physiques (p. ex., à différentes vitesses d’écoulement et tailles de pores), dans la présente étude, une plateforme microfluidique est développée pour visualiser le développement du biofilm à l’aide d’un microscope dans des conditions physiques contrôlées imposées de l’extérieur. L’accumulation de pression induite par le biofilm dans le milieu poreux peut être mesurée simultanément à l’aide de capteurs de pression et, plus tard, corrélée avec la couverture de surface du biofilm. La plateforme présentée fournit une base de référence pour une approche systématique visant à étudier le biocolmatage causé par les biofilms dans les milieux poreux dans des conditions d’écoulement et peut être adaptée à l’étude d’isolats environnementaux ou de biofilms multi-espèces.

Introduction

Les biofilms – colonies bactériennes intégrées dans une matrice autosécrétée de substances extra-polymères (PSE) – sont omniprésents dans les milieux poreux naturels, tels que les sols et les aquifères¹, et les applications techniques et médicales, telles que la bioremédiation², la filtration de l’eau³ et les dispositifs médicaux⁴. La matrice du biofilm est composée de polysaccharides, de fibres protéiques et d’ADN extracellulaire^5,6, et dépend fortement des micro-organismes, de la disponibilité des nutriments^, ainsi que des conditions environnementales⁷. Pourtant, les fonctions de la matrice sont universelles; Il forme l’échafaudage de la structure du biofilm, protège la communauté microbienne des contraintes mécaniques et chimiques et est en grande partie responsable des propriétés rhéologiques des biofilms⁵.

Dans les milieux poreux, la croissance de biofilms peut obstruer les pores, provoquant ce qu’on appelle le biocolmatage. Le développement du biofilm est contrôlé par l’écoulement du fluide et la taille des pores, définis comme la distance séparant deux piliers, du milieu poreux ^8,9,10. La taille des pores et l’écoulement du fluide contrôlent le transport des nutriments et les forces de cisaillement locales. À son tour, le biofilm en croissance obstrue les pores, affectant la distribution de vitesse du fluide 11,12,13, le transport de masse et la conductivité hydraulique du milieu poreux ^14,15. Les changements de conductivité hydraulique se traduisent par une augmentation de la pression dans les systèmes confinés^16,17,18,19. Les études microfluidiques actuelles sur le développement de biofilms et le biocolmatage se concentrent sur l’étude de l’impact des vitesses d’écoulement dans des géométries homogènes^16,20 (c’est-à-dire avec une taille de pores singulière) ou des milieux poreux hétérogènes^12,21,22. Cependant, pour démêler les effets des débits et de la taille des pores sur le développement du biofilm et les changements de pression qui en résultent dans le milieu poreux biobouché, une plate-forme expérimentale hautement contrôlable et polyvalente permettant l’étude de différentes géométries de milieux poreux et conditions environnementales en parallèle est nécessaire.

La présente étude présente une plateforme microfluidique qui combine des mesures de pression avec l’imagerie simultanée du biofilm en évolution dans le milieu poreux. En raison de sa perméabilité aux gaz, de sa biocompatibilité et de sa flexibilité dans la conception de la géométrie du canal, un dispositif microfluidique en polydiméthylsiloxane (PDMS) est un outil approprié pour étudier le développement de biofilms dans des milieux poreux. La microfluidique permet de contrôler les conditions physiques et chimiques (p. ex., l’écoulement des fluides et la concentration en éléments nutritifs) avec une grande précision pour imiter l’environnement des habitats microbiens²³. De plus, les dispositifs microfluidiques peuvent facilement être imagés avec une résolution micrométrique à l’aide d’un microscope optique et couplés à des mesures en ligne (par exemple, la pression locale).

Dans ce travail, les expériences se concentrent sur l’étude de l’impact de la taille des pores dans un milieu poreux homogène analogue dans des conditions d’écoulement imposé contrôlé. Le débit d’un milieu de culture est imposé à l’aide d’une pompe à seringue et la différence de pression à travers le canal microfluidique est mesurée simultanément avec des capteurs de pression. Le développement du biofilm est initié par l’ensemencement d’une culture planctonique de Bacillus subtilis dans le canal microfluidique. L’imagerie régulière du biofilm en évolution et l’analyse d’images permettent d’obtenir des informations résolues à l’échelle des pores sur la couverture de surface dans diverses conditions expérimentales. Les informations corrélées sur le changement de pression et l’étendue du biocolmatage fournissent des données cruciales pour les estimations de la perméabilité des milieux poreux bioobstrués.

Protocol

1. Préparation de plaquettes de silicium Concevoir les géométries du canal microfluidique dans un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO; voir Tableau des matériaux) et l’imprimer sur un film transparent pour créer le photomasque (Figure 1A). Fabriquez le moule maître par lithographie douce (dans des conditions de salle blanche) en suivant les étapes ci-dessous.Cuire la plaquette de silicium à 200 °C penda…

Representative Results

Pour la présente étude, un dispositif microfluidique avec trois canaux microfluidiques parallèles avec différentes tailles de pores a été utilisé (Figure 1) pour étudier systématiquement la formation de biofilm dans des milieux poreux. Le processus de formation du biofilm a été visualisé à l’aide de la microscopie à fond clair. Les cellules bactériennes et le biofilm sont apparus dans les images sous forme de pixels plus foncés (Figure 2). De p…

Discussion

Les analogues de milieux poreux microfluidiques couplés à des capteurs de pression fournissent un outil approprié pour étudier le développement du biofilm dans les milieux poreux. La polyvalence dans la conception du milieu poreux microfluidique, en particulier la disposition des piliers, y compris le diamètre, les formes irrégulières et la taille des pores, permet l’étude de nombreuses géométries. Ces géométries vont des pores simples aux obstacles très complexes et disposés de manière irrégulière im…

Materials

Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to fill the channel with deionised water
Box Incubator	Life Imaging Services		used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
CorelCAD	CorelDRAW		software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile)	greiner bio-one		Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line	VWR		Oven to cure the PDMS
Handy	Migros		Detergent solution
Hot plate with temperature control	VRW		to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ	FIJI		Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubator
Isopropanol (> 99.8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar)	Elveflow		Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm	Integra		Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Nutrient broth n°3	Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock	B.Braun		syringes of different volume
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	to dry the glass slide
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150	Sawatec
SU8 3050 Photoresist	Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Tissue culture dish 150	TPP	93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometer