Una piattaforma microfluidica per studiare il bioclogging in mezzi porosi

Summary

Il presente protocollo descrive una piattaforma microfluidica per studiare lo sviluppo di biofilm in mezzi porosi quasi-2D combinando l’imaging al microscopio ad alta risoluzione con misurazioni simultanee della differenza di pressione. La piattaforma quantifica l’influenza della dimensione dei pori e delle portate del fluido nei mezzi porosi sul biointasamento.

Abstract

I biofilm batterici si trovano in diversi mezzi porosi ambientali e industriali, compresi i terreni e le membrane di filtrazione. I biofilm crescono in determinate condizioni di flusso e possono ostruire i pori, reindirizzando così il flusso locale del fluido. La capacità dei biofilm di ostruire i pori, il cosiddetto biointasamento, può avere un enorme effetto sulla permeabilità locale del mezzo poroso, creando un accumulo di pressione nel sistema e influenzando il flusso di massa attraverso di esso. Per comprendere l’interazione tra la crescita del biofilm e il flusso del fluido in diverse condizioni fisiche (ad esempio, a diverse velocità di flusso e dimensioni dei pori), nel presente studio, viene sviluppata una piattaforma microfluidica per visualizzare lo sviluppo del biofilm utilizzando un microscopio in condizioni fisiche controllate imposte dall’esterno. L’accumulo di pressione indotto dal biofilm nel mezzo poroso può essere misurato simultaneamente utilizzando sensori di pressione e, successivamente, correlato con la copertura superficiale del biofilm. La piattaforma presentata fornisce una base per un approccio sistematico per studiare il bioclogging causato da biofilm in mezzi porosi in condizioni di flusso e può essere adattata allo studio di isolati ambientali o biofilm multispecie.

Introduction

I biofilm – colonie batteriche incorporate in una matrice auto-secreta di sostanze extrapolimeriche (EPS) – sono onnipresenti nei mezzi porosi naturali, come terreni e falde acquifere¹, e nelle applicazioni tecniche e mediche, come il biorisanamento², la filtrazione dell’acqua³ e i dispositivi medici⁴. La matrice del biofilm è composta da polisaccaridi, fibre proteiche e DNA extracellulare^5,6 e dipende fortemente dai microrganismi^, dalla disponibilità di nutrienti e dalle condizioni ambientali⁷. Tuttavia, le funzioni della matrice sono universali; Costituisce l’impalcatura della struttura del biofilm, protegge la comunità microbica dalle sollecitazioni meccaniche e chimiche ed è in gran parte responsabile delle proprietà reologiche dei biofilm⁵.

Nei mezzi porosi, la crescita dei biofilm può ostruire i pori, causando il cosiddetto biointasamento. Lo sviluppo del biofilm è controllato dal flusso del fluido e dalla dimensione dei pori, definita come la distanza che separa due pilastri, del mezzo poroso ^8,9,10. Sia la dimensione dei pori che il flusso del fluido controllano il trasporto dei nutrienti e le forze di taglio locali. A sua volta, il biofilm in crescita ostruisce i pori, influenzando la distribuzione della velocità del fluido 11,12,13, il trasporto di massa e la conduttività idraulica del mezzo poroso ^14,15. Le variazioni della conducibilità idraulica si riflettono attraverso l’aumento della pressione nei sistemi confinati 16,17,18,19. Gli attuali studi microfluidici nello sviluppo di biofilm e bioclogging si concentrano sullo studio dell’impatto delle velocità di flusso in geometrie omogenee^16,20 (cioè con una dimensione dei pori singolare) o mezzi porosi eterogenei^12,21,22. Tuttavia, per districare gli effetti delle portate e della dimensione dei pori sullo sviluppo del biofilm e le conseguenti variazioni di pressione nel mezzo poroso biointasato, è necessaria una piattaforma sperimentale altamente controllabile e versatile che consenta lo studio di diverse geometrie porose e condizioni ambientali in parallelo.

Il presente studio introduce una piattaforma microfluidica che combina misurazioni della pressione con l’imaging simultaneo del biofilm in evoluzione all’interno del mezzo poroso. Grazie alla sua permeabilità ai gas, alla biocompatibilità e alla flessibilità nella progettazione della geometria del canale, un dispositivo microfluidico in polidimetilsilossano (PDMS) è uno strumento adatto per studiare lo sviluppo di biofilm in mezzi porosi. La microfluidica consente il controllo delle condizioni fisiche e chimiche (ad esempio, flusso di fluidi e concentrazione di nutrienti) con elevata precisione per imitare l’ambiente degli habitat microbici²³. Inoltre, i dispositivi microfluidici possono essere facilmente ripresi con risoluzione micrometrica utilizzando un microscopio ottico e accoppiati con misurazioni online (ad esempio, la pressione locale).

In questo lavoro, gli esperimenti si concentrano sullo studio dell’impatto della dimensione dei pori in un analogo poroso omogeneo in condizioni di flusso imposte controllate. Il flusso di un terreno di coltura viene imposto utilizzando una pompa a siringa e la differenza di pressione attraverso il canale microfluidico viene misurata simultaneamente con sensori di pressione. Lo sviluppo del biofilm è iniziato seminando una coltura planctonica di Bacillus subtilis nel canale microfluidico. L’imaging regolare del biofilm in evoluzione e l’analisi delle immagini consentono di ottenere informazioni risolte in scala di pori sulla copertura superficiale in varie condizioni sperimentali. Le informazioni correlate del cambiamento di pressione e l’estensione del bioclogging forniscono input cruciali per le stime della permeabilità dei mezzi porosi biointasati.

Protocol

1. Preparazione del wafer di silicio Progettare le geometrie del canale microfluidico in software di progettazione assistita da computer (CAD; vedi Table of Materials) e stamparlo su una pellicola trasparente per creare la fotomaschera (Figura 1A). Fabbricare lo stampo principale mediante litografia morbida (in condizioni di camera bianca) seguendo i passaggi seguenti.Cuocere il wafer di silicio a 200 °C per 2 ore. Pos…

Representative Results

Per il presente studio, è stato utilizzato un dispositivo microfluidico con tre canali microfluidici paralleli con diverse dimensioni dei pori (Figura 1) per studiare sistematicamente la formazione di biofilm in mezzi porosi. Il processo di formazione del biofilm è stato visualizzato utilizzando la microscopia a campo chiaro. Le cellule batteriche e il biofilm sono apparsi nelle immagini come pixel più scuri (Figura 2). Inoltre, è stato osservato un graduale…

Discussion

Gli analoghi dei fluidi porosi microfluidici accoppiati con sensori di pressione forniscono uno strumento adatto per studiare lo sviluppo di biofilm in mezzi porosi. La versatilità nella progettazione del mezzo poroso microfluidico, in particolare la disposizione dei pilastri, compreso il diametro, le forme irregolari e la dimensione dei pori, consente l’indagine di molte geometrie. Queste geometrie vanno da singoli pori a ostacoli altamente complessi e disposti in modo irregolare che imitano diversi mezzi porosi natura…

Materials

Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to fill the channel with deionised water
Box Incubator	Life Imaging Services		used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
CorelCAD	CorelDRAW		software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile)	greiner bio-one		Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line	VWR		Oven to cure the PDMS
Handy	Migros		Detergent solution
Hot plate with temperature control	VRW		to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ	FIJI		Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubator
Isopropanol (> 99.8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar)	Elveflow		Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm	Integra		Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Nutrient broth n°3	Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock	B.Braun		syringes of different volume
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	to dry the glass slide
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150	Sawatec
SU8 3050 Photoresist	Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Tissue culture dish 150	TPP	93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometer