손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 가지 허브 조합 전략 탐색
Summary
이 프로토콜은 손상된 PC12 세포를 치료하기 위해 두 허브의 조합 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 중국 전통 의학(TCM)의 최상의 적용 모드를 최적화하기 위한 참조를 제공합니다.
Abstract
뇌 허혈 치료에서 중국 전통 의학(TCM) 조합의 이점을 고려하여 손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 가지 허브 조합 전략을 탐구하기 위해 제제 조합과 성분 조합 간의 효능 및 메커니즘의 차이를 연구했습니다. 글루코오스가 없는 배지와 결합된 염화코발트(CoCl2)를 사용하여PC12 세포의 산화적 손상을 유도하였다. 이어서, 황기몽홀리쿠 스(Ast)와 에리 게론 브레비스카푸 스(Eri) 주사제의 최적 조합을 선정하고, PC12 세포에 대한 안전하고 효과적인 농도를 스크리닝한 후 균일한 설계 방법에 따라 조합하였다. 또한, 스크리닝된 성분 조합은 2개의 허브에 10μM 아스트라갈로시드 A, 40μM 스쿠텔라린, 및 75μM 클로로겐산을 포함한다. 그런 다음 MTT, Annexin V-FITC / PI, 면역 형광 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 손상된 PC12 세포에서 제제 조합 및 성분 조합의 효능 및 메커니즘을 평가했습니다. 그 결과 세포 생존 촉진을 위한 최적의 제제 조합은 6:1.8(μM) 농도의 Ast 주사와 Eri 캡슐이었습니다. 성분 조합(10μM 아스트라갈로시드 A, 40μM 스쿠텔라린, 및 75μM 클로로겐산)이 제제 조합보다 더 효과적이었습니다. 두 조합 모두 세포 사멸 속도, 카스파제 -3의 형광 강도 및 세포 내 활성 산소 종 (ROS) 수준을 현저하게 감소시켰다. 한편, 그들은 p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax 및 Nrf2의 발현 수준을 상향 조절했다. 이러한 효과는 성분 조합에서 더 분명했습니다. 결론적으로, 두 조합 모두 PC12 세포 상의 무포도당 배지와 결합된CoCl2 에 의해 유도된 손상을 억제할 수 있고, 따라서 세포 생존을 촉진할 수 있다. 그러나, 제제 조합에 비해 성분 조합의 효율은 산화 스트레스 및 세포 사멸과 관련된 PI3K / Akt / Nrf2 신호 전달 경로의 더 강한 조절 때문일 수있다.
Introduction
뇌저관류로 인한 만성 뇌허혈은 중년 및 노인에게 흔한 질환입니다1. 장기 잠복성 허혈 질환으로서 진행성 또는 지속적인 신경 기능 장애로 이어질 수 있습니다. 주요 병리학 적 메커니즘에는 세포 사멸 및 산화 적 손상이 포함되며 진행성 또는 지속적인 신경 기능 장애를 유발합니다. 이것은 알츠하이머 병, 혈관성 치매 및 기타 질병의 병리학 적 기초이며 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다. 그러나 만성 뇌 허혈을 치료하기위한 현대 의학의 이상적인 약물은 여전히 부족합니다2. 동시에, 황기 몽홀리쿠 스(Ast)와 에리게론 브레비스카푸스 (Eri)의 조합은 중국 전통 의학(TCM)의 임상 실습에서 널리 사용되었습니다.4. 병용 전략은 뇌 허혈 후 신경 기능의 회복을 촉진하는 데 현저하게 개선되었으며, 이는 단일 약물보다 우수합니다. 그러나, 두 약물의 조합에서 투여 비율에는 큰 차이가 있습니다4. 효과적인 구성 요소와 작용 메커니즘이 잘 정의되어 있지 않아 임상 적용을 제한하는 핵심 문제입니다.
이전 연구는 쥐의 뇌 허혈 치료에서 Ast 주사와 Eri 주사의 제제 조합의 시너지 효과를 입증했습니다. p-Akt 단백질의 발현을 상향조절하고 B-림프모세포종 2(Bcl-2) 계열 단백질 중 하나인 Bcl-2 관련 사멸 촉진제(BAD) 단백질 5,6의 발현을 하향조절하여 세포사멸을 촉진하는 효과가 있습니다. 그러나 시너지 효과의 물질적 근거와 메커니즘은 명확하지 않습니다. 또한, PC12 세포의 손상 모델을CoCl2 조합 무포도당 배지로 확립하고, Ast 및 Eri에서의 최적 성분 조합을 스크리닝하고 7로 정의하였다.
이 연구에서, Ast 및 Eri의 유효 투여량은 손상된 PC12 세포 모델을 사용하여 스크리닝된다. 두 약물의 최적 조합은 균질 설계 방법과 결합 된이 모델을 사용하여 스크리닝됩니다. 세포 모델은 손상된 PC12 세포에서 제제 조합과 성분 조합의 효과 및 메커니즘의 차이를 추가로 평가하는 데 사용됩니다. 이 전략은 PI3K/Akt/Nrf2 신호 경로를 통해 손상된 PC12 세포에 대한 두 가지 유형의 조합의 보호 효과 및 조절 메커니즘을 탐색하여 최상의 조합 모드를 결정하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 TCM의 최상의 애플리케이션 모드를 최적화하기위한 참고 자료를 제공합니다.
Protocol
1. 시약의 제조 125mL 멸균 배양 플라스크에 90mL의 DMEM 고당 배지, 10mL의 소 태아 혈청(FBS) 및 1mL의 페니실린-스트렙토마이신 용액을 추가하여 완전한 배지를 준비합니다. 전체 배지를 혼합하고, 폐쇄 조건 하에서 4°C에서 저장한다. DMEM 무설탕 배지 (완전히 용해 됨) 10mL에 0.02g의 CoCl2 분말 (정확하게 칭량)을 첨가하여 CoCl2 용액을 준비하여 8.4mM 원액을 얻습?…
Representative Results
Ast 주사와 Eri 캡슐의 최적 조합의 스크리닝은 그림 1에 나와 있습니다. 정상 PC12 세포에 대한 Ast 주사 및 Eri 캡슐의 세포 생존율은 도 1A에 나타내었다. 세포 생존율은 12 μM 이상의 농도에서 Ast 주사 (그림 1A) 및 5 μM 이상의 농도에서 Eri 캡슐 (그림 1A)에서 95 %보다 낮았으며, 이는 최대 무독성 농도가 각각 12 μ…
Discussion
현대 임상 실습에서 뇌 허혈 치료를위한 이상적인 약물은 여전히 부족합니다2. 기를 보충하고 혈액 순환 방법을 활성화시키는 지침에 따라 Ast, Eri 및 기타 제제가 TCM의 임상 실습에서 병용되어 왔으며 우수한 종합 이점을 달성했습니다13,14,15. 많은 연구에 따르면 Ast는 혈액 뇌 장벽의 투과성을 향상시키고 뇌 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 쓰촨성 과학기술부(2020YFS0325)의 주요 R&D 프로젝트에서 자금을 지원받았습니다.
Materials
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | – | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | – | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
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Citer Cet Article
Zhang, J., Yan, Y., Cheng, F., Huang, F., Xie, X., Sheng, Y. Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells. J. Vis. Exp. (189), e64721, doi:10.3791/64721 (2022).