マイクロダイセクションとホールマウント走査型電子顕微鏡によるマウス脈絡叢の可視化
Summary
神経科学で十分に研究されていない組織である脈絡叢(CP)は、中枢神経系の健康と病気に重要な役割を果たしています。このプロトコルは、CPを単離するためのマイクロダイセクション技術と、その細胞構造の全体像を得るための走査型電子顕微鏡の使用について説明しています。
Abstract
脈絡叢(CP)は、脳の心室に突き出た高度に血管新生した構造であり、神経科学で最も研究されていない組織の1つです。この小さな構造が中枢神経系(CNS)の健康と病気に重要な役割を果たしていることがますます明らかになるにつれて、機能解析から構造解析に至るまで、下流の処理を可能にする方法で脳室からCPを適切に解剖することが最も重要です。ここでは、特殊なツールまたは機器を必要としない側脳室および第4脳室マウスCPの単離について説明する。この単離技術は、CP内の細胞の生存率、機能、および構造を維持します。その高い血管新生のために、CPは双眼顕微鏡を使用して脳の心室腔内に浮かんでいるのを視覚化することができる。しかしながら、下流の分析に必要な経心的灌流は、CP組織の同定を複雑にする可能性がある。さらなる処理ステップ(RNAおよびタンパク質分析など)に応じて、これはブロモフェノールブルーとの経心灌流 を介して CPを視覚化することによって解決することができる。単離後、CPは、RNA、タンパク質、または単一細胞分析を含むいくつかの技術を使用して処理され、この特別な脳構造の機能についてさらに理解することができます。ここでは、マウントCP全体の走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、構造の全体像を把握します。
Introduction
タイトなバリアは、血液脳関門(BBB)や血液脳脊髄液(CSF)バリアなど、中枢神経系(CNS)を末梢から分離します。これらの障壁は、CNSを外部の侮辱から保護し、バランスのとれた制御された微小環境を保証します1,2,3。BBBは時間をかけて広く研究されてきましたが、脈絡叢(CP)にある血液CSFバリアは、過去10年間で研究の関心が高まっています。この後者の障壁は、脳の4つの脳室に見られ(図1A、B)、中心間質、漏出毛細血管、線維芽細胞、およびリンパ系および骨髄系細胞集団を取り巻く脈絡叢上皮(CPE)細胞の単層によって特徴付けられます(図1C)4,5,6 .CPE細胞はタイトジャンクションによってしっかりと相互接続されているため、下にある開窓毛細血管からCSFと脳への漏れを防ぎます。さらに、CPE細胞を横切る輸送は、血液からCSFへの有益な化合物(例えば、栄養素およびホルモン)の流入および有害分子(例えば、代謝廃棄物、過剰な神経伝達物質)の流出を他の方向へ管理する多数の内向きおよび外向き輸送システムによって調節される1,6。CPE細胞は、その能動輸送機能を発揮するために、細胞質内に多数のミトコンドリアを含む7。さらに、CPはCSFの主な供給源であり、常在する炎症細胞の存在によって脳のゲートキーパーとして機能します1。血液と脳の間のその独特の位置のために、CPはまた、免疫監視を実行するのに最適な位置にあります8。
図1:脈絡叢(CP)の位置と組成の概略概要 。 (A,B)CP組織は、(A)ヒトおよび(B)マウス脳の2つの側方脳室、第3脳室、および第4脳室内に見出される。(C)CP組織は、開窓毛細血管、緩い結合組織、リンパ系および骨髄系細胞を取り囲む緊密に接続された直方体CP上皮(CPE)細胞の単層からなり、血液脳脊髄液バリアを形成する(参考文献23から適応および修正)。Biorender.com で作成した図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
過去10年間で、私たちの研究グループからのいくつかの報告を含むますます多くの証拠が、CPが健康と病気の中心的な役割を果たしていることが明らかになりました9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 .例えば、老化した血液-CSFバリアは、とりわけ、核、微絨毛、および基底膜に形態学的変化を示すことが知られている1,19。さらに、アルツハイマー病の状況では、全体的なバリアの完全性が損なわれ、これらの加齢に伴う変化はすべてさらに顕著であるように見えます1、8、20。形態学的変化に加えて、CPのトランスクリプトーム、プロテオーム、およびセクレトームは、疾患12、21、22、23の間に変化します。したがって、CPの高度な知識は、神経疾患におけるCPの役割をよりよく理解し、新しい治療戦略を開発するために不可欠です。
脳室からのCPの正確なマイクロダイセクションのための効率的な方法は、この小さな脳構造の適切な調査を可能にする最初の貴重なステップです。その高度に血管新生した性質(図2B)のために、脳の心室腔内に浮かぶCPは双眼顕微鏡を使用して識別することができます。しかし、下流の分析には経心灌流が必要になることが多く、CP組織の適切な同定と分離が複雑になります(図2C)。さらなる処理ステップが許す場合(例えば、RNAおよびタンパク質分析の場合)、CPはブロモフェノールブルーによる経心灌流 を介して 視覚化することができる(図2A)。いくつかの刊行物は、ラット24 およびマウス仔の脳25からのCPの単離を既に記載している。ここでは、成体マウスからCPを単離するための微小解剖単離技術について説明する。重要なことに、この単離技術は、CP内の細胞の生存率、機能、および構造を維持します。ここでは、第4脳室および側脳室に浮遊するCPの単離について説明する。要するに、マウスは終末麻酔され、必要に応じて経心灌流される。しかしながら、灌流はCP内の細胞の構造を損傷する可能性があることに注意すべきである。したがって、透過型電子顕微鏡(TEM)、シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBF-SEM)、または集束イオンビームSEM(FIB-SEM)を使用してサンプルを分析する場合は、灌流を実行しないでください。次に、脳全体を隔離し、鉗子を使用して脳を矢状に半解します。ここから、側脳室に浮遊するCPを特定して解剖し、第4脳室のCPを脳の小脳側から分離することができます。
図2:(A,D)ブロモフェノールブルー灌流後の(A-C)第4および(D-F)側脳室脈絡叢(CP)の可視化、(B,E)灌流なし、および(C,F)PBS /ヘパリンによる灌流。 画像は実体顕微鏡(8倍〜32倍の倍率)で撮影されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
CPが脳室から適切に解剖されると、この構造の機能についてさらに理解するために、技術のレパートリー全体を適用することができます。例えば、フローサイトメトリーまたはシングルセルRNAシーケンシングは、特定の疾患条件下で浸潤炎症細胞を定量および表現型的に分析するために行うことができる26、27。細胞組成に加えて、CPの分子組成を分析して、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、イムノブロット を介して 、またはサイトカインビーズアレイ28を用いた複数のサイトカインの同時分析を通じて、サイトカインおよびケモカインの存在を評価することができる。さらに、トランスクリプトーム、血管、免疫細胞組織学、およびセクレトーム解析は、微小解剖されたCP外植片29に対して行うことができる。ここでは、CP全体のマウントCP上の走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、CP構造の全体像を取得します。SEMは、集束された電子のビームを使用して表面をスキャンし、表面の地形と組成の画像を作成します。電子の波長は光よりもはるかに小さいため、SEMの分解能はナノメートル範囲であり、光学顕微鏡よりも優れています。その結果、細胞内レベルでの形態学的研究は SEMを介して 行うことができる。 簡単に言えば、解剖されたCPは、一晩固定するためにグルタルアルデヒド含有固定液に直ちに移され、続いてオスミケーションおよび酢酸ウラニル染色が行われる。次に、サンプルをアスパラギン酸鉛染色で処理し、脱水し、最終的にイメージング用に埋め込みます。
したがって、このプロトコルは、マウス脳室からのCPの効率的な単離を容易にし、その構造および機能を調査するために様々な下流技術を用いてさらに分析することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、脈絡叢(CP)をマウス脳の側脳室及び第四脳室から分離する方法について説明する。CPのこの全体のマウント方法は、CPの形態、細胞組成、トランスクリプトーム、プロテオーム、およびセクレトームの完全なビューを取得するための技術のレパートリーを使用したさらなる分析を容易にします。このような分析は、脳室から突き出ているこの驚くべき構造をよりよく理解するために?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ベルギーアルツハイマー病研究財団(SAO、プロジェクト番号:20200032)、フランダース研究財団(FWO Vlaanderen、プロジェクト番号:1268823N、11D0520N、1195021N)、およびBaillet Latour基金の支援を受けました。VIBバイオイメージングコアのトレーニング、サポート、インストゥルメントパークへのアクセスに感謝します。
Materials
| 26G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | |
| Aluminium specimen mounts | EM Sciences | 75220 | |
| Cacodylate buffer | EM Sciences | 11652 | |
| Carbon steel surgial blades | Swann-Morton | 0210 | size: 0.45 mm x 12 mm |
| Carbon adhesive tabs -12 mm | EM Sciences | 77825-12 | |
| Critical point dryer | Bal-Tec | CPD030 | |
| Crossbeam 540 | Zeiss | SEM system | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Glutaraldehyde | EM Sciences | 16220 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H-3125 | |
| Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel | Metrohm Belgium N.V | CPA-7800160 | |
| Osmium Tetroxide | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| Platinum | Quorum | Q150T ES | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
| Sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Specimen Basket Stainless Steel | EM Sciences | 70190-01 | |
| Stemi DV4 Stereo microscope | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 |
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