In vitro Undersøkelse av effekten av den hyaluronanrike ekstracellulære matrisen på migrasjon av nevrale kamceller
Summary
Denne protokollen skisserer et in vitro migrasjonseksperiment egnet for funksjonell analyse av molekylene involvert i in vivo migrasjon av nevrale kamceller inn i den hyaluronanrike ekstracellulære matrisen.
Abstract
Nevrale kamceller (NCCs) er svært migrerende celler som stammer fra den dorsale regionen av nevrale røret. Utvandringen av NCC fra nerverøret er en viktig prosess for NCC-produksjon og deres påfølgende migrasjon mot mållokaliteter. Migrasjonsruten til NCCs, inkludert det omkringliggende nevrale rørvevet, involverer hyaluronan (HA) -rik ekstracellulær matriks. For å modellere NCC-migrasjon i disse HA-rike omkringliggende vevene fra nevralrøret, ble det i denne studien etablert en blandet substratmigrasjonsanalyse bestående av HA (gjennomsnittlig molekylvekt: 1,200-1,400 kDa) og kollagen type I (Col1). Denne migrasjonsanalysen viser at NCC-cellelinjen, O9-1, celler er svært migrerende på det blandede substratet, og at HA-belegget brytes ned på stedet for fokale adhesjoner i løpet av migrasjonen. Denne in vitro-modellen kan være nyttig for videre utforskning av det mekanistiske grunnlaget som er involvert i NCC-migrasjon. Denne protokollen er også anvendelig for evaluering av ulike underlag som stillaser for å studere NCC-migrasjon.
Introduction
Nevrale kamceller (NCCs) er en multipotent cellepopulasjon som er tilstede i å utvikle embryoer, og de stammer fra nevralplategrensen under neurulasjon. De bidrar til dannelsen av en rekke vev, inkludert det perifere nervesystemet, kardiovaskulærsystemet, kraniofacial vev og skjelettet1. Etter induksjon og NCC-spesifisering ved nevralplategrensen emigrerer NCCer fra nevroepitelet og migrerer mot NCC-avledede vevssteder1.
Hyaluronan (HA) er en ikke-sulfatert glykosaminoglykan som distribueres i en rekke vev som en komponent i den ekstracellulære matriksen (ECM). Betydningen av hyaluronsyre i embryoutvikling har blitt demonstrert i modellsystemer gjennom ablasjon av gener som er ansvarlige for hyaluronans metabolisme. For eksempel ble mutasjoner i hyaluronansyntasegener (Has1 og Has2) i Xenopus funnet å føre til NCC-migrasjonsdefekter og kraniofacial misdannelse2. I tillegg er det rapportert at HA-bindende proteoglykaner, aggrekan og versikan, har hatt hemmende effekter på NCC-migrasjon3. Hos mus fører Has2-ablasjon til alvorlige defekter i endokardial putedannelse, noe som resulterer i middels drektighet (E9.5-10) dødelighet 4,5,6.
Transmembranprotein 2 (Tmem2), en hyaluronidase på celleoverflaten, har nylig vist seg å spille en kritisk rolle i å fremme integrinmediert kreftcelleadhesjon og migrasjon ved å fjerne matriksassosiert HA ved adhesjonsstedene 7,8. Mer nylig har Inubushi et al.9 vist at mangel på Tmem2 fører til alvorlige kraniofaciale defekter på grunn av abnormiteter i NCC utvandring/migrasjon og overlevelse. I den forrige studien9 ble Tmem2-uttrykk analysert under NCC-dannelse og migrasjon. Tmem2-ekspresjon ble observert på stedet for NCC-delaminering og hos emigrerende Sox9-positive NCCer (figur 1). I tillegg, ved bruk av Tmem2-utarmede O9-1 nevrale kamceller fra mus, viste studien at in vitro-ekspresjonen av Tmem2 var avgjørende for at O9-1-cellene skulle danne fokaladhesjoner og for deres migrasjon til HA-holdige substrater (figur 2 og figur 3) 9.
Disse resultatene tyder sterkt på at Tmem2 også er viktig for NCC-adhesjon og migrasjon gjennom den HA-rike ECM. Imidlertid er den molekylære mekanismen for NCC-adhesjon og migrasjon innenfor den HA-rike ECM fortsatt uklar. Det er derfor nødvendig å etablere et in vitro kultureksperimentelt system for å fullt ut utforske NCC-adhesjon og migrasjon innenfor den HA-rike ECM.
Av de mange tilnærmingene som brukes til å teste cellemigrasjon, er cellesårlukkingsbasert analyse en enkel metode som ofte brukes innen fysiologi og onkologi10. Denne tilnærmingen er nyttig på grunn av dens relevans for in vivo-fenotypen og er effektiv for å bestemme rollene til narkotika og kjemoattraktanter under cellemigrasjon11. Det er mulig å evaluere migrasjonsevnen til både hele cellemasser og individuelle celler ved å måle cellegapavstandene over tid11. I dette manuskriptet introduseres en modifisert in vitro sårlukkingsbasert analyse for å modellere NCC-migrasjon i HA-rikt vev rundt nevralrøret. Denne prosedyren er også anvendelig for å studere forskjellige ECM-komponenter (dvs. kollagen, fibronektin og laminin) for å analysere rollen til ECM-stillaset i NCC-migrasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ulike ECM-komponenter regulerer NCC utvandring/migrasjon. For eksempel regulerer HA NCC-migrasjon 2,15 positivt. Interessant nok belyste en studie basert på genetiske musemodeller av Tmem2, en celleoverflatehyaluronidase, kravet om HA-nedbrytning i NCC-migrasjon9. Kollagen er også rikelig i ECM som omgir nevrale røret16. Decorin, en liten leucinrik proteoglykan, har vist seg å regulere NCC-migrasjon under nevral…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeg vil uttrykke stor takknemlighet til Fumitoshi Irie og Yu Yamaguchi for deres oppmuntring og gode forslag til å etablere denne metoden. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til vitenskapelige forskningsprogrammer fra Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 til TI, #20H03896 til TI). Den opprinnelige metoden for belegging av HA på glasssubstrater og in situ HA-nedbrytningsanalyser på substratene ble beskrevet i Yamamoto et al. (2017) 8, mens metoden for fremstilling av HA/Col1 blandede substrater ble beskrevet i Irie et al. (2021) 7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
