Обнаружение продукции активных форм кислорода в иммунном ответе риса в режиме реального времени с помощью хемилюминесцентного анализа
Summary
Здесь мы описываем метод обнаружения в режиме реального времени продукции апопластических активных форм кислорода (АФК) в тканях риса в иммунном ответе, вызванном патогенным молекулярным паттерном. Этот метод прост, стандартизирован и дает высоковоспроизводимые результаты в контролируемых условиях.
Abstract
Активные формы кислорода (АФК) играют жизненно важную роль в различных биологических процессах, включая обнаружение абиотических и биотических стрессов. При заражении патогеном или контакте с химическими веществами, связанными с патогенами (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны [PAMP]), в растениях быстро индуцируется множество иммунных реакций, включая взрыв АФК, что называется иммунитетом, вызванным PAMP (PTI). Всплеск АФК является отличительной реакцией PTI, которая катализируется группой локализованных в плазматической мембране НАДФН-оксидаз – белков семейства RBOH. Подавляющее большинство АФК содержит перекись водорода (H2O2), которая может быть легко и стабильно обнаружена методом хемилюминесценции на основе люминола. Хемилюминесценция представляет собой реакцию, продуцирующую фотоны, в которой люминол или его производное (например, L-012) подвергается окислительно-восстановительной реакции с АФК под действием катализатора. В этой статье описывается оптимизированный метод хемилюминесценции на основе L-012 для обнаружения продукции апопласта АФК в режиме реального времени при выявлении PAMP в тканях риса. Метод прост, устойчив, стандартизирован и легко воспроизводим в строго контролируемых условиях.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК) включают ряд химически активных производных кислорода, включая супероксидные анионные радикалы (O2-) и его производные, гидроксильные радикалы (OH-), перекись водорода и продукты синглетного кислорода или окислительно-восстановительных реакций, которые постоянно образуются в пластидах и хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и других субклеточных участках 1 . АФК играют важную роль во многих биологических процессах и необходимы для всех растений 2,3,4. Широкий спектр функций АФК варьируется от регуляции роста и развития до восприятия абиотических и биотических стрессов 5,6,7,8.
В иммунной системе растений рецепторы, локализованные в плазматической мембране растительных клеток – так называемые рецепторы распознавания образов (PRR) – воспринимают химические вещества, полученные из патогенов, – молекулярные паттерны, связанные с патогенами (PAMP). Это распознавание запускает серию быстрых иммунных реакций, включая приток кальция, взрыв АФК и каскад MAPK; таким образом, этот уровень иммунитета называется иммунитетом, вызванным PAMP (PTI). Всплеск АФК является отличительной реакцией PTI, определение которой широко применяется в исследованиях, связанных с PTI 9,10. Продукция АФК, инициируемая PAMP, объясняется резидентной плазматической мембраной белками семейства НАДФН-оксидазы или гомолога респираторной взрывооксидазы (RBOH), которые переносят электроны из цитозольного НАДФН или НАДН во внеклеточный кислород с образованием супероксида (O2–), который спонтанно превращается в перекись водорода (H2O2O2) супероксиддисмутазой8 . Всплеск АФК, вызванный PAMP, довольно быстрый, появляется всего через несколько минут после лечения PAMP и достигает пика через ~ 10-12 минут. Подавляющее большинство молекул АФК содержит перекись водорода (H2O2), которую можно легко и стабильно обнаружить с помощью хемилюминесцентного анализа.
При хемилюминесценции хемилюминесцентный реагент реагирует с активным кислородом под действием катализатора с образованием промежуточных продуктов возбужденного состояния. Затем электроны в продукте возвращаются в основное состояние посредством безызлучательного перехода и испускают фотоны. Общие хемилюминесцентные реагенты включают люминол и L-012, причем люминол доминирует в применении11,12,13. Тем не менее, все больше исследователей выбирают L-012 для обнаружения образования АФК, поскольку L-012 имеет гораздо более высокую эффективность светового излучения в нейтральных или почти нейтральных условиях pH по сравнению с люминолом.
В данной работе описывается оптимизированный метод хемилюминесценции, основанный на L-012, для обнаружения продукции АФК в режиме реального времени после выявления PAMP в тканях риса (Oryza sativa), листовых дисках и оболочке. Представленный здесь метод прост, стабилен и стандартизирован и легко адаптируется к различным экспериментальным потребностям. Данные, полученные с помощью этого метода, обладают высокой воспроизводимостью в строго контролируемых условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель этого исследования состояла в том, чтобы создать высокоэффективный метод количественной оценки ранней продукции АФК в ответ на ПАМП в тканях риса. Этот метод обеспечивает стандартизированную процедуру определения в режиме реального времени апопластных АФК, полученных из обрабо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Шанхайского фонда естественных наук (номер гранта: 21ZR1429300 / BS1500016), Шанхайского университета Цзяотун (программа Agri-X, номер гранта: AF1500088/002), Шанхайского совместного инновационного центра сельскохозяйственных семян (номер гранта: ZXWH2150201/001) для Цзянбо Фана и Проекта сотрудничества в области медицины и инженерии Шанхайского университета Цзяотун (номер гранта: 21X010301734) для Кан Ли.
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).
