Detección en tiempo real de la producción reactiva de especies de oxígeno en la respuesta inmune en el arroz con un ensayo de quimioluminiscencia
Summary
Aquí, describimos un método para la detección en tiempo real de la producción de especies reactivas de oxígeno apoplásico (ROS) en tejidos de arroz en la respuesta inmune desencadenada por patrones moleculares asociados a patógenos. Este método es simple, estandarizado y genera resultados altamente reproducibles en condiciones controladas.
Abstract
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel vital en una variedad de procesos biológicos, incluida la detección de estreses abióticos y bióticos. Tras la infección del patógeno o el desafío con productos químicos asociados a patógenos (patrones moleculares asociados a patógenos [PAMP]), se induce rápidamente una serie de respuestas inmunes, incluida una explosión de ROS, en las plantas, lo que se denomina inmunidad activada por PAMP (PTI). Una explosión de ROS es una respuesta PTI distintiva, que es catalizada por un grupo de NADPH oxidasas localizadas en la membrana plasmática, las proteínas de la familia RBOH. La gran mayoría de las ROS comprenden peróxido de hidrógeno (H2O2), que puede detectarse fácil y constantemente mediante un método de quimioluminiscencia basado en luminol. La quimioluminiscencia es una reacción productora de fotones en la que el luminol, o su derivado (como L-012), sufre una reacción redox con ROS bajo la acción de un catalizador. Este documento describe un método optimizado de quimioluminiscencia basado en L-012 para detectar la producción de ROS de apoplast en tiempo real tras la obtención de PAMP en tejidos de arroz. El método es fácil, estable, estandarizado y altamente reproducible bajo condiciones firmemente controladas.
Introduction
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) comprenden una serie de derivados de oxígeno químicamente activos, incluidos los radicales aniónicos superóxido (O2-) y sus derivados, radicales hidroxilo (OH-), peróxido de hidrógeno y productos de oxígeno singlete o reacciones de oxidación-reducción, que se producen constantemente en plastidios y cloroplastos, mitocondrias, peroxisomas y otras ubicaciones subcelulares1 . Las ROS juegan un papel importante en muchos procesos biológicos y son esenciales para todas las plantas 2,3,4. El amplio espectro de funciones de ROS varía desde la regulación del crecimiento y desarrollo hasta la percepción de estreses abióticos y bióticos 5,6,7,8.
En el sistema inmune de las plantas, los receptores localizados en la membrana plasmática de las células vegetales, los llamados receptores de reconocimiento de patrones (PRR), perciben patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) de productos químicos derivados de patógenos. Este reconocimiento desencadena una serie de respuestas inmunes rápidas, incluyendo la afluencia de calcio, la explosión de ROS y la cascada MAPK; por lo tanto, esta capa de inmunidad se denomina inmunidad activada por PAMP (PTI). La ruptura de ROS es una respuesta de PTI distintiva, cuya determinación se aplica ampliamente a los estudios relacionados con PTI 9,10. La producción de ROS desencadenada por PAMPs se atribuye a la NADPH oxidasa residente en la membrana plasmática, o proteínas de la familia homóloga de oxidasa de explosión respiratoria (RBOH), que transfieren electrones de NADPH o NADH citosólico a oxígeno extracelular para producir superóxido (O2–) que se convierte espontáneamente en peróxido de hidrógeno (H2O2) por la superóxido dismutasa8 . La explosión de ROS activada por PAMP es bastante rápida, aparece solo unos minutos después del tratamiento con PAMP y alcanza un máximo de ~ 10-12 min. La gran mayoría de las moléculas de ROS comprenden peróxido de hidrógeno (H2O2), que se puede detectar de manera fácil y constante con un ensayo de quimioluminiscencia.
En la quimioluminiscencia, el reactivo de quimioluminiscencia reacciona con el oxígeno activo, bajo la acción de un catalizador, para producir los intermedios del estado excitado. Luego, los electrones en el producto regresan al estado fundamental a través de una transición no radiativa y emiten fotones. Los reactivos de quimioluminiscencia comunes incluyen luminol y L-012, con luminol dominando la aplicación11,12,13. Sin embargo, más investigadores están eligiendo L-012 para detectar la producción de ROS, ya que L-012 tiene una eficiencia de emisión de luz mucho mayor en condiciones de pH neutro o casi neutro en comparación con el luminol.
Este artículo describe un método de quimioluminiscencia optimizado, basado en L-012, para la detección en tiempo real de la producción de ROS después de la obtención de PAMPs en discos y vaina de tejidos de arroz (Oryza sativa). El método proporcionado aquí es simple, estable y estandarizado, y es altamente adaptable para satisfacer diferentes necesidades experimentales. Los datos obtenidos con este método son altamente reproducibles en condiciones firmemente controladas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El propósito de este estudio fue establecer un método altamente eficiente para cuantificar la producción temprana de ROS en respuesta a PAMP en tejidos de arroz. Este método proporciona un procedimiento estandarizado para la determinación en tiempo real de ROS de apoplast producidas a partir de tejidos de arroz tratados. Este método es simple en operación, bajo en costo, claro en composición e independiente de los kits comerciales. Usando este método, los investigadores pueden estudiar la producción en tiempo r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghai (Número de subvención: 21ZR1429300 / BS1500016), la Universidad Jiao Tong de Shanghai (programa Agri-X, Número de subvención: AF1500088 / 002), el Centro de Innovación Colaborativa de Semillas Agrícolas de Shanghai (Número de subvención: ZXWH2150201 / 001) a Jiangbo Fan, y por el Proyecto de Colaboración de Ingeniería Médica de la Universidad Jiao Tong de Shanghai (número de subvención: 21X010301734) a Can Li.
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
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