Summary
Vanwege de veelzijdige toepassing als modelsoort in verschillende vakgebieden, is er behoefte aan een toolkit voor genetische transformatie in smalbladige weegbree (Plantago lanceolata). Hier wordt met behulp van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie een protocol gepresenteerd dat resulteert in stabiele transgene lijnen met een transformatie-efficiëntie van 20%.
Abstract
Soorten in het geslacht Plantago hebben verschillende unieke eigenschappen die ertoe hebben geleid dat ze zijn aangepast als modelplanten in verschillende vakgebieden. Het ontbreken van een genetisch manipulatiesysteem verhindert echter diepgaand onderzoek naar de genfunctie, waardoor de veelzijdigheid van dit geslacht als model wordt beperkt. Hier wordt een transformatieprotocol gepresenteerd voor Plantago lanceolata, de meest bestudeerde Plantago-soort. Met behulp van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie werden 3 weken oude wortels van aseptisch gegroeide P. lanceolata-planten geïnfecteerd met bacteriën, gedurende 2-3 dagen geïncubeerd en vervolgens overgebracht naar een opname-inductiemedium met de juiste antibioticaselectie. Scheuten kwamen meestal na 1 maand uit het medium en wortels ontwikkelden zich 1-4 weken nadat de scheuten waren overgebracht naar het wortelinductiemedium. De planten werden vervolgens geacclimatiseerd aan een bodemomgeving en getest op de aanwezigheid van een transgen met behulp van de β-glucuronidase (GUS) reporter-assay. De transformatie-efficiëntie van de huidige methode is ~ 20%, met twee transgene planten die per 10 getransformeerde wortelweefsels verschijnen. Het opstellen van een transformatieprotocol voor smalbladige weegbree zal de adoptie van deze plant als nieuwe modelsoort in verschillende gebieden vergemakkelijken.
Introduction
Het concept van het gebruik van modelsoorten om meerdere aspecten van de plantenbiologie te onderzoeken, ontstond met het wijdverbreide gebruik van Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis werd aanvankelijk gekozen omdat het kenmerken deelt met veel andere bloeiende planten en meerdere eigenschappen heeft die het gemakkelijk maken om in een laboratoriumomgeving te studeren, zoals klein zijn en een korte generatiecyclus hebben. De grote hoeveelheid onderzoeksartikelen die met het als onderwerp zijn gepubliceerd, samen met de kleine genoomgrootte en het gemak van genetische transformatie2, stellen het in staat om te blijven bestaan als een veelgebruikt experimenteel organisme. Arabidopsis kan echter worden beperkt als model voor soorten met verschillende kenmerken of unieke eigenschappen3. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe modelsystemen, zoals maïs (Zea mays), een belangrijke plant voor ontwikkelingsgenetica in eenzaadlobbigen4, en tomaat (Solanum lycopersicum), die een belangrijk model is voor evolutionaire studies, fruitontwikkeling en productie, en een goede vertegenwoordiging is voor groentegewassen5. Een methode voor genetische transformatie is een voorwaarde voor een plantensoort om als modelorganismete dienen 2. Een Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie is een betrouwbaar hulpmiddel in de plantenbiologie; het is gebruikt om enkele modelsoorten en belangrijke gewassen te transformeren, waaronder tabak (Nicotiana tabacum)6, rijst (Oryza sativa)7, katoen (Gossypium hirsutum)8, soja (Glycine max)9, aardappel (Solanum tuberosum)10 en koolzaad (Brassica napus)11. Plantensoorten zijn zeer variabel in hoe succesvol ze reageren op A. tumefaciens-infectie, en transformatieprotocollen moeten vaak individueel worden afgestemd op elke soort 6,12.
Het geslacht Plantago omvat in totaal 256 plantensoorten, wijd verspreid wereldwijd13. De soorten in dit geslacht hebben vaak unieke kenmerken die ze wenselijk maken als modelsoort voor het bestuderen van genetica, ecologie, stressfysiologie, secundaire metabolieten, medicinale chemie, plant-microbe interacties, plantenontwikkeling en evolutie. Plantago lanceolata , ook wel de smalbladige of ribwort weegbree genoemd, is een populaire plant van belang sinds de19e eeuw, toen het voor het eerst werd gebruikt om het fenomeen van mannelijke steriliteit te beschrijven14. Net als andere planten van zijn geslacht, is het gebruikt in studies op verschillende onderzoeksgebieden. Meer recent is het voorgesteld als een model voor vasculaire biologie, omdat het vaatweefsel gemakkelijk kan worden verzameld15. P. lanceolata is de meest bestudeerde soort in het geslacht Plantago; een artikel uit 2021 meldde dat er op dat moment >1.400 publicaties waren met of met betrekking tot deze soort16, en nog eens 102 artikelen zijn gepubliceerd sinds het begin van 2022, volgens een PubMed-zoekopdracht uitgevoerd op 9december 2022. De volgende meest bestudeerde plant in het geslacht, P. major, is het onderwerp van slechts 414 artikelen wanneer gezocht met behulp van dezelfde criteria op dezelfde datum.
Ondanks de onderzoeksinteresse in P. lanceolata, worden studies, vooral over genfunctiekarakterisering, vaak beperkt door het ontbreken van een toolkit voor genetische manipulatie voor de soort. Pommerrienig et al. hebben zich ingespannen om een transformatieprotocol voor P. major te ontwikkelen met behulp van een floral dip-techniek17. Deze methode kan echter niet worden toegepast op P. lanceolata vanwege de mannelijke steriliteit die kenmerkend is voor deze soort18,19. Voor zover wij weten, bestaat er geen bestaand protocol voor de transformatie van P. lanceolata.
Deze studie presenteert een eenvoudig protocol voor A. tumefaciens-gemedieerde transformatie van P. lanceolata. Door zich te richten op wortelweefsels kunnen volgroeide transgene planten binnen 3 maanden na transformatie worden gegenereerd.
Protocol
OPMERKING: Stap 1.4-1.8, 2.3-2.5, 3.3-3.6, 4.1-4.6, 5.1-5.7 en 6.1-6.3 moeten worden uitgevoerd in aseptische omstandigheden, met behulp van een schone kap om besmetting te voorkomen.
1. Vermeerdering van plantaardig materiaal voor transformatie
- Plaats in de handel verkrijgbare wild-type (WT) Plantago lanceolata zaden (zie tabel van materialen) in een 50 ml centrifugebuis tot de 5 ml lijn, afhankelijk van het gewenste aantal planten.
OPMERKING: Als alternatief kan een microcentrifugebuis van 2 ml worden gebruikt wanneer een klein aantal zaden nodig is, maar deze moet worden gevuld tot een volume van niet meer dan 0,1 ml, omdat te veel zaden de efficiëntie van sterilisatie kunnen verminderen. - Dompel de zaden gedurende 60 s onder in 75% ethanol.
- Gooi de ethanol weg en dompel de zaden vervolgens gedurende 40 minuten onder in 20% natriumhypochloriet (20% NaClO, 80% steriel water) en keer de buis voorzichtig om zodat alle zaden in contact komen met de oplossing.
OPMERKING: De natriumhypochlorietoplossing moet vers worden gemaakt voor een optimaal resultaat. - Gooi onder een laminaire stroomkap de natriumhypochlorietoplossing weg en was de zaden vervolgens met gedestilleerd water (vijf keer). Voeg een klein volume water toe aan de zaden na de laatste spoeling, omdat dit de beweging van de planten op platen kan helpen.
- Breng met behulp van een gesteriliseerde tang de zaden over op vooraf bereide petrischalen van 95 mm x 100 mm met stevig MS-medium (tabel 1). Verdeel de zaden gelijkmatig over het oppervlak van de plaat, met ongeveer 1 cm tussen elk zaadje om overbevolking van de gekiemde zaailingen te voorkomen (figuur 1A).
- Sluit de platen af met twee lagen paraffinefilm om besmetting te voorkomen en incubeer vervolgens onder een koel wit groeilicht (zie materiaaltabel) bij kamertemperatuur (22 °C met 50 μmol m-2 s-1, 12 uurdagen). De zaden ontkiemen meestal binnen 5-6 dagen.
- Wanneer de zaailingen zijn ontkiemd en groot genoeg zijn om over te brengen (figuur 1B), meestal 2 of 3 dagen na ontkieming, gebruik dan een gesteriliseerde tang om de zaailingen over te brengen in steriele dozen met de 50-100 ml MS-medium (tabel 1). Plant idealiter slechts vijf zaailingen per doos om de beste kwaliteit wortels te verkrijgen.
- Sluit de dozen af met chirurgische tape en laat de planten vervolgens groeien onder een koel wit groeilicht (zie materiaaltabel), in dezelfde omstandigheden als vermeld in stap 1.6. De planten moeten klaar zijn voor transformatie in ongeveer 3-4 weken, of wanneer de hoofdwortels ongeveer 2 cm lang zijn geworden en de laterale wortels wit lijken.
OPMERKING: Recepten voor middelgrote bereiding en vitaminevoorraden zijn opgenomen in tabel 1 en tabel 2.
2. Plasmideconstructie en E. Coli-transformatie
OPMERKING: De exacte plasmideconstructieprocedure varieert afhankelijk van het gen van belang. In deze procedure werden de restrictie-enzymen HindIII en SalII gebruikt om de 1,5 kb AtPP2-promotor in het binaire plasmide pBI101 (zie Tabel van materialen) met GUS in te brengen, met behulp van de standaard kloonprocedure20. AtPP2 (floëemeiwit 2) is een gen dat specifiek tot expressie komt in floëem21.
- Kloon de promotor met behulp van primerparen 5'-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3' (Forward) en 5'-AGTCGTCGACACAACAGTATGATGATGTATTTATTTG-3' (Reverse) van Arabidopsis. Figuur 2 toont een diagram van de binaire plasmidevector met de AtPP2:GUS-insert .
- Transformeer na plasmideconstructie de plasmiden in DH5a E. coli (zie materiaaltabel) competente cellen met behulp van de heat shock-methode22 en incuber vervolgens gedurende 1,5 uur bij 37 °C met schudden (150 tpm).
- Neem 150 μL van elke omzettingscultuur, plaat op LB-agarmediaplaten (tabel 1) met de juiste selectie (50 mg/l kanamycine voor de stam die in dit protocol wordt gebruikt; zie tabel met materialen) en incuber de platen vervolgens gedurende 16-24 uur bij 37 °C.
OPMERKING: De bacteriestam die in dit onderzoek wordt gebruikt, is A. tumefaciens GV3101. - Gebruik vervolgens kolonie-PCR om de kolonies te screenen op positieve recombinanten23.
OPMERKING: In dit protocol werden de volgende primers gebruikt om het beoogde gen te versterken; 5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3'(Forward) en 5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3' (Reverse).- Voer de reactie uit in een thermocycler (zie materiaaltabel) met cyclusomstandigheden van 3 minuten bij 95 °C, gevolgd door 35 cycli van: 30 s bij 95 °C, 30 s bij 55 °C, 2 minuten bij 72 °C en een laatste rekstap van 10 minuten bij 72 °C.
- Ent de positieve kolonies in 6 ml LB-bouillon (tabel 1) met het juiste antibioticum (50 mg / L kanamycine) en groei 's nachts bij 37 °C, bij 200-250 tpm.
- Na een nacht groeien, extraheer de plasmiden uit de bacteriën met behulp van standaardprocedures24.
3. A. tumefaciens transformatie met plasmide
- Gebruik na plasmide-extractie elektroporatie om het gemodificeerde plasmide om te zetten in de gewenste stam van competente cellen. Bij deze procedure werd A. tumefaciens stam GV3101 gebruikt. Volg gestandaardiseerde methoden voor elektroporatietechnieken25.
- Na elektroporatie, resuspendien de bevoegde cellen in 1 ml LB-bouillon en incubeer vervolgens gedurende 2-4 uur bij 28 ° C bij 100 tpm.
- Verzamel de cellen door centrifugatie bij 6.800 x g gedurende 3 minuten in een tafelmicrocentrifuge (zie materiaaltabel) bij kamertemperatuur (22 °C) en verspreid vervolgens 50-100 μl op een LB-agarplaat met een geschikt selectiemiddel (50 mg / L kanamycine voor het plasmide dat in dit protocol wordt gebruikt).
- Nadat de cellen gedurende 2 dagen bij 28 °C zijn geïncubeerd, identificeert u positieve kolonies die het gen van belang bevatten door het gebruik van kolonie-PCR. Gebruik in dit protocol de primers en voorwaarden die in stap 2.4 worden genoemd.
- Gebruik vervolgens de positieve kolonies om een voorraadplaat te strepen met LB-agarmedia + selectie. De plaat kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
- Als alternatief, voor langdurige opslag, een positieve kolonie enten met een klein volume LB met de juiste selectie. Schud de geënte cultuur 's nachts bij 28 °C bij 200 tpm en bereid vervolgens een glycerolbouillon (50% w / v glycerol in een 50:50 mix van bacteriën en glycerol), die tot 10 jaar bij -80 °C kan worden bewaard.
4. A. tumefaciens preparaat
- Streep A. tumefaciens met het gewenste plasmide op geprepareerde massieve LB-platen van 95 mm x 100 mm met het juiste selectiemiddel. In dit protocol werd de bacteriestam GV3101 met de plasmide-insert AtPP2:GUS gebruikt, met 50 mg/L kanamycine toegevoegd voor de selectie.
- Sluit de platen af met paraffinefilm en incubeer vervolgens bij 28 °C gedurende maximaal 48 uur, of totdat de bacterie groot genoeg wordt om te plukken.
- Gebruik een pipetpunt om een bacteriekolonie 2 dagen voor transformatie te plukken en ent deze in een ronde bodembuis van 15 ml met 6 ml vloeibare LB met de juiste selectie. Schud 's nachts bij 200 rpm in een tafelblad van 28 °C, totdat OD600 0,6-0,7 bereikt.
OPMERKING: Platen en de bacteriële inenting van 6 ml kunnen maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard. - Wanneer de bacteriën de juiste OD 600 bereiken, gebruikt u een pipet om A. tumefaciens over te brengen naar een steriele kolf met100 ml vloeibare LB met een selectiemiddel. Typisch, 200 μL bacteriën per 100 ml LB is geschikt voor vermeerdering. Schud 's nachts bij 200 tpm bij 28 °C, totdat OD600 0,6-0,7 bereikt.
- Breng de bacteriën over in steriele centrifugebuizen van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (22 °C) bij 2.200 xg in een tafelcentrifuge om de bacteriën te verzamelen.
- Gooi het supernatant weg met een pipet. Resuspensie van de bacteriële pellet in 5 ml vloeistofsuspensieoplossing (SS) (22 °C) (tabel 1) door pipetteren, voeg vervolgens tot 50 ml RVS toe en keer meerdere keren om om te mengen. De bacterie is nu klaar voor transformatie.
OPMERKING: De vloeibare SS moet vers worden bereid, binnen 1 week na transformatie.
LET OP: Al het materiaal dat in contact komt met A. tumefaciens moet worden weggegooid in een biohazard afvalbak. Overgebleven vloeistoffen uit bacterieculturen kunnen worden gesteriliseerd met natriumhypochloriet (bleekmiddel) in een concentratie van 20% of hoger.
5. Transformatie van Plantago wortels
- Wanneer de planten het ideale stadium voor transformatie bereiken (zaailingen zijn 3 weken oud) (figuur 1C), gebruik dan een steriele tang en schaar om de wortels van de rest van de plant te scheiden (figuur 3A). Gooi het blad- en stengelmateriaal weg.
- Breng de wortelstukken onmiddellijk na het snijden over in steriele dozen met steriel water met behulp van een steriele tang. Deze stap zorgt ervoor dat de wortels gehydrateerd blijven terwijl al het weefsel wordt verzameld.
- Wanneer alle wortels zijn gesneden, giet u de A. tumefaciens/SS-suspensie in steriele petrischaaltjes van 150 mm x 15 mm. Breng de wortels over in de A . tumefacienscultuur en ent gedurende ten minste 20 minuten (figuur 3B).
- Gebruik tijdens de incubatie een steriel scalpel met een scherp mes om de wortels in fragmenten van 1 cm te snijden, waarbij de primaire wortels van de laterale wortels worden gescheiden. Maak dunne, ondiepe sneden op het oppervlak van de wortels om de bacteriën de plant te laten infecteren.
OPMERKING: Als u te maken heeft met een groot aantal planten, breng dan de wortelstukken in batches over in de bacteriecultuur om ervoor te zorgen dat alle wortels tijdens de inenting worden ondergedompeld. - Gebruik na de incubatie de steriele tang om de wortelstukken over te brengen naar steriele papieren handdoeken om overtollige bacteriën te verwijderen. Vermijd het drogen van de wortels gedurende meer dan 60 s, omdat dit uitdroging kan veroorzaken en het wortelweefsel kan beschadigen. Idealiter kunnen 10-15 wortels tegelijkertijd worden gedroogd (figuur 3C).
- Breng de gedroogde wortels over in bereide petrischalen van 95 mm x 15 mm met vaste cocultuurmedia (tabel 1), ongeveer 10-20 wortels per plaat, afhankelijk van de grootte van de wortels (figuur 3D).
- Sluit de platen af met twee lagen transparante plastic folie en dek ze af met aluminiumfolie. Incubeer bij kamertemperatuur (22 °C) gedurende 3 dagen. Deze stap biedt de bacteriën de tijd om de wortels te infecteren zonder de aanwezigheid van een antibioticumselectie (figuur 3E).
6. Selectie en regeneratie van de hele plant
- Breng na incubatie in co-kweekmedia de wortelstukken over in bereide petrischalen van 95 mm x 15 mm met vaste opname-inductiemedia (SIM) (tabel 1) met timentine (500 mg/l; zie materiaaltabel) en de juiste antibioticaselectie. In dit protocol gebruikten we kanamycine (100 mg / L).
OPMERKING: De onderkant van de wortels moet volledig in contact komen met het medium. Wortels die het oppervlak van het medium niet raken, zijn te lang en moeten worden gesneden om te voorkomen dat het weefsel aan selectie ontsnapt. - Sluit de platen af met twee lagen transparante plastic folie en groei vervolgens gedurende 1 maand onder een groeilicht (zie stap 1.6 voor de juiste omstandigheden), of totdat de scheuten beginnen te verschijnen.
OPMERKING: Meestal kunnen de initialen van de scheut worden waargenomen na 2 weken groei en zijn de scheuten meestal zichtbaar na 1 maand. - Wanneer de plantjes 1,5-2,0 cm lang zijn (figuur 1D), breng ze dan over in voorbereide steriele dozen met vaste wortelinductiemedia (tabel 1).
- Kweek de planten onder een groeilicht (zie stap 1.6 voor de omstandigheden) gedurende enkele weken, totdat zich wortels vormen. Wortels zijn meestal voor het eerst te zien na 1 week.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de wortels enkele weken te laten groeien voordat ze naar de grond gaan, omdat planten met grotere wortelstelsels de neiging hebben om een hogere overlevingskans in de grond te hebben.
7. Bodemoverdracht
- Wanneer de wortelsystemen groot genoeg zijn geworden om over te brengen (figuur 1E), meestal na 1 maand groei, breng je de planten over in 3,5 in vierkante potten met voorbevochtigde universele grond (BM7). In dit protocol is BM7 schorsmix gebruikt (zie Materiaaltabel).
- Verwijder elk medium dat aan de wortels kleeft door ze voorzichtig in water te wassen.
OPMERKING: De planten kunnen tot wasdom worden gekweekt in een kas bij 800 tot 1400 μmol fotonen m-2 s-2 met behulp van 600 W hoge natriumdruklampen (zie materiaaltabel), of in een groeikamer bij kamertemperatuur (22 °C) met koele witte lichten bij 50 μmol m-2 s-1, 12 uur dagen.
- Verwijder elk medium dat aan de wortels kleeft door ze voorzichtig in water te wassen.
- Bedek de planten met een plastic potdeksel en bedek ze vervolgens met een doorzichtige plastic zak. Deze stap zorgt ervoor dat de planten in een vochtige omgeving blijven terwijl ze zich aanpassen aan de bodem.
- Verwijder na ongeveer 3-5 dagen de plastic zak en verwijder vervolgens langzaam het deksel om te kunnen wennen aan de buitenomgeving.
OPMERKING: Afhankelijk van de tijd van het jaar en de omgeving waarin de planten worden overgebracht, kan de tijd die de planten nodig hebben om zich aan te passen variëren. Het wordt aanbevolen om de planten dagelijks te controleren en indien nodig water aan de potten toe te voegen. - Geef de planten regelmatig water en voeg indien nodig meststof toe. Planten kunnen ook worden overgebracht naar grotere potten voor verdere groei (figuur 1F).
8. β-glucuronidase (GUS) histochemische kleuring
- Bereid β-glucuronidase (GUS) kleuringsoplossing, volgens gepubliceerde protocollen15.
- Wanneer de initialen van de scheut ongeveer 0,5-1 cm lang zijn, verwijdert u een kleine punt van een jong, volledig geëxpandeerd blad (<5 mm lang is meestal voldoende) en brengt u onmiddellijk over op 0,5-1 ml GUS-kleuringsoplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 of 2 ml. De oplossing moet het plantenweefsel volledig bedekken.
- Plaats de geopende buizen in een vacuümexsiccator en vacuüm op 20-25 kPa gedurende 5-10 minuten. Kleine belletjes moeten zichtbaar zijn in de oplossing tijdens de vacuümprocedure. Hierdoor kan de oplossing de cellen van de plant binnendringen.
- Laat de lucht terug filteren in de vacuüm exsiccator. Sluit de buizen en incubeer bij 37 °C gedurende een nacht (12 uur), of totdat de blauwe kleur zichtbaar is.
OPMERKING: In deze studie was GUS-activiteit gelokaliseerd in het floëem, wat betekent dat in positief getransformeerde planten blauwe kleuring alleen zichtbaar zou moeten zijn in het floëemweefsel. Planten zonder het transgen ervaren geen vlekken (figuur 4). - Om de vlek beter te visualiseren, breng je de planten over op 100% ethanol om chlorofyl te verwijderen. Om de efficiëntie van het chlorofylverwijderingsproces te verhogen, incubeer de buizen gedurende 10 minuten bij 60 °C.
OPMERKING: De ethanol moet mogelijk meerdere keren worden vervangen voordat alle chlorofyl wordt verwijderd, afhankelijk van de grootte van het blad dat wordt gekleurd.
Representative Results
Een eenvoudig protocol wordt hier gerapporteerd voor het verkrijgen van transgene P. lanceolata-planten met behulp van A. tumefaciens-gemedieerde transformatie. Het reportergen GUS (dat codeert voor β-glucuronidase) wordt, aangedreven door de floëem-tot expressie gebrachte promotor van AtPP2, omgezet in 3 weken oude P. lanceolata-wortels via A. tumefaciens-stam GV3101 (figuur 2). Een floëem-specifieke promotor werd gekozen omdat onze belangrijkste interesse was om een systeem op te zetten voor de functionele genomica van plantaardige vasculaire weefsels, met name floëem. De methode werd getest op het wortel-, blad- en bladbladbladweefsel in het voorlopige experiment. Hoewel eelt in alle weefseltypen kon worden geïnduceerd, produceerde alleen het wortelweefsel scheutinitialen (figuur 5A) na 1 maand in SIM; het blad en de bladsteel werden bruin en stierven af (figuur 5B). Dit leidde tot de conclusie dat wortelweefsel het optimale weefseltype was voor gebruik in de transformatiemethode. De wortels werden geïncubeerd in de bereide bacteriën die gedurende minimaal 20 minuten in suspensieoplossing (SS) (tabel 1) werden geresuspendeerd en vervolgens gedurende maximaal 3 dagen in het donker bij kamertemperatuur op vaste SS-platen geïncubeerd (figuur 3E). De wortels werden vervolgens overgebracht naar het opname-inductiemedium (SIM) en onder een groeilicht gehouden, onder de omstandigheden die zijn aangegeven in het protocol (stap 1.6). Figuur 1 en figuur 3 tonen representatieve beelden van elke stap van het protocol ter referentie.
Figuur 6 toont de progressie van de initialen van de scheuten die uit getransformeerd weefsel tevoorschijn komen, vanaf de eerste dag dat de wortels op de SIM werden geplaatst (figuur 6A) tot wanneer de scheuten klaar waren om te worden geworteld (figuur 6D). Na 1 week vormde het wortelweefsel eelt (figuur 6B) en kon het begin van de initialen van de scheut worden waargenomen (figuur 6B1). In week 2 en 3 bleven scheuten tevoorschijn komen (figuur 6C) en na 4 weken waren de scheuten klaar om te worden overgebracht naar het wortelinductiemedium (figuur 6D).
Identificatie van de vermeende transgene planten werd uitgevoerd met behulp van de histochemische test β-glucuronidase (GUS), met behulp van bladsegmenten die werden genomen zodra de scheuten ongeveer 0,5 cm lang waren. Positieve transgene planten vertoonden het verwachte kleuringspatroon in het floëem gelokaliseerde weefsel, aangetoond in figuur 4. Positieve GUS-gekleurde scheuten werden overgebracht naar het wortelinductiemedium, waarin ze na 4 weken robuuste wortelsystemen ontwikkelden (figuur 1E). Gewortelde planten werden vervolgens overgebracht naar de grond. Figuur 4 toont het resultaat van kleuring in een smalbladige weegbree getransformeerd met de AtPP2-promotor en het β-glucuronidase (GUS) gen, samen met een wild-type en een smalbladige weegbree getransformeerd met de AtPP2-promotor, ter vergelijking. Alle scheuten die tevoorschijn kwamen, werden bevestigd als transgeen. De transformatie-efficiëntie werd vastgesteld op een gemiddelde van 20%, met ongeveer twee scheuten die uitkwamen voor elke 10 wortels die werden getransformeerd. Bevestigde transgene planten werden overgebracht naar grotere potten en gedurende 4-8 weken gekweekt totdat ze het volwassen stadium bereikten (figuur 1F).
Figuur 1: Tijdlijn van plantago lanceolata transformatie. Representatieve beelden van elke fase van het protocol. (A) Niet-germineerde zaden die op een MS-plaat zijn geplateerd. (B) Zaden ontkiemd na 1 week, klaar om te worden overgebracht naar magenta dozen. (C) Planten in MS-dozen na 3 weken groei. Wortels zijn groen en gezond, in het ideale stadium voor transformatie. (D) Scheuten in opname-inductiemedia na 4 weken zijn klaar om te worden overgebracht naar het bewortelingsmedium. In dit stadium kan β-glucuronidase (GUS) histochemische kleuring worden uitgevoerd, indien van toepassing. (E) Planten in dozen met wortelinductiemedia, waar wortels zich na 4 weken groei hebben gevormd. (F) Transgene planten worden na 4 weken groei in de bodem tot de volle lengte gekweekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Diagram van de binaire vector plasmide pBI101 + β-glucuronidase (GUS) met de ingebrachte floëem-specifieke promotor AtPP2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stappen van transformatie. Representatieve afbeeldingen van elke stap van transformatie. (A) Het scheiden van wortels van scheuten tijdens transformatie. (B) Wortels weken in bacteriën/SS-suspensie. (C) Drogen van wortels op keukenpapier om overtollige bacteriën te verwijderen. (D) Wortels verguld op co-cultuur medium. (E) SS-platen gewikkeld in aluminiumfolie. Planten werden 2-3 dagen geïncubeerd voordat ze werden overgebracht naar het schietmedium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: GUS-kleuring . β-glucuronidase (GUS) kleuringsresultaten van smalbladige weegbree bladsegmenten. (A) Wild type. (B) Smalbladige weegbree getransformeerd met het plasmide dat de AtPP2-promotor herbergt (lege vector). (C) Smalbladige weegbree getransformeerd met het plasmide dat de AtPP2-promotor en het β-glucuronidase (GUS) -gen herbergt. Elk blad werd gekleurd met behulp van het GUS histochemische kleuringsprotocol en vervolgens afgebeeld met een microscopische camera. Afbeeldingen (B) en (C) tonen geen kleuringspatroon vanwege de afwezigheid van het GUS-gen. De rechter afbeelding toont een helderblauw kleurpatroon in de aderen, wat bevestigt dat de planten transgeen zijn. De staaf vertegenwoordigt 1 mm, waarbij elk bladsegment ongeveer 1 cm lang is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van transformatie-efficiëntie van verschillende weefseltypen na >1 maand incubatie op opnamemedia . (A) Wortelweefsels na meer dan 1 maand groei. Wortels hebben uitgebreide eelt ervaren en er zijn initialen van scheuten ontstaan. Niet-getransformeerd eelt is begonnen te sterven als reactie op antibioticaselectie. (B) Blad- en bladsteelweefsels na meer dan 1 maand groei. Weefsels ervoeren enige eeltexpansie, maar stierven al snel als reactie op het antibioticum. Uit beide weefsels kwamen geen scheuten tevoorschijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Ontstaan van eelt en scheuten op getransformeerd weefsel. Representatieve afbeeldingen van weefsels geplaatst op schietmedium na verschillende incubatielengtes. (A) Wortelweefsel net nadat het op het schietmedium is geplateerd. (B) Wortelweefsel na 1 week op schietmedium. Er is eeltexpansie waar te nemen en (B1) de eerste scheutinitialen beginnen te verschijnen. (C) Wortelweefsel na 3 weken op schietmedium. Er zijn meer shoot initialen opgedoken. (C1) De shoot die voortkwam uit de B1 shoot initiërend. (D) Wortelweefsels na 4 weken incubatie. Niet-getransformeerd weefsel is begonnen zwart / bruin te worden en af te sterven, en opkomende scheuten blijven groeien. In dit stadium zijn scheuten klaar om naar het wortelmedium te worden verplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Mediabereidingsrecepten. Een beschrijving van hoe mediums voor te bereiden op transformatie. De hoeveelheid toegevoegde vitamines wordt berekend op basis van de aangegeven concentratie van de stamoplossing. Zie tabel 2 voor de bereiding van de vitaminebouillonoplossing. Voeg voor alle mediums reagentia toe aan 900 ml dubbel gedestilleerd H2O, pH tot het aangegeven niveau en voeg vervolgens water toe tot een eindvolume van 1.000 ml. * = toevoegen na sterilisatie. ** = pH met 1 M KOH. = pH met 1 M NaOH. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Vitaminevoorraden voor Plantago mediums. Alle vitamines moeten worden gefilterd, gesteriliseerd en nauwkeurig geëtiketteerd voordat ze worden opgeslagen. Los de poeders indien aangegeven eerst op in 1 N NaOH en vul vervolgens het gewenste volume aan met dubbel gedestilleerd H2O. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Het ontbreken van een transformatieprotocol voor planten in het geslacht Plantago beperkt het gebruik van deze planten als modellen, vooral wanneer onderzoekers geïnteresseerd zijn in het onderzoeken van genfuncties. P. lanceolata werd gekozen om een genetisch transformatieprotocol te ontwikkelen omdat het de meest bestudeerde plant van zijn geslacht16 is. Het protocol dat is ontwikkeld, zal waarschijnlijk worden gebruikt als een hulpmiddel om studies met betrekking tot vasculaire biologie, ecologie, plant-insect interacties en abiotische stressfysiologie verder te bevorderen.
Het gepresenteerde protocol schetst duidelijk stappen waarmee een gebruiker transgene planten kan verkrijgen. Naast het vermogen van P. lanceolata om te gedijen in een weefselkweekomgeving, hebben meerdere factoren bijgedragen aan het succes van onze transformatiemethode. Ten eerste werd het belang waargenomen van het gebruik van hoogwaardig, steriel plantenwortelweefsel voor transformatie. Wortels hadden de hoogste transformatiesnelheden wanneer ze werden genomen van 3-4 weken oude planten en groen of bleekwit lekwit lek lek. Wortels uit dozen met enige hoeveelheid bacteriële of schimmelbesmetting resulteerden vaak in besmette schietculturen en oudere wortels die bruin leken, resulteerden niet in een succesvolle transformatie. Wortelweefsel was het meest efficiënte weefseltype voor transformatie met behulp van de huidige methode, omdat blad- en bladbladbladweefsel niet succesvol waren in het ontwikkelen van scheuten.
Een andere belangrijke observatie was dat de optimale methode voor het verzamelen van wortelweefsel voor transformatie was om vers gesneden wortelmateriaal in steriel water te plaatsen. Deze stap zorgde er effectief voor dat wortelmateriaal gehydrateerd bleef terwijl de rest van het weefsel werd verzameld, omdat wortels de neiging hebben om snel uit te drogen wanneer ze uit hun groeicontainers worden verwijderd. Deze stap hielp ook om het slagingspercentage van de transformatie te verhogen, omdat er meer wortels tegelijk in de bacteriën konden worden geïncubeerd.
Dit protocol kan worden gewijzigd door de tijd dat het wortelweefsel incubeert in de co-kweekmedia te verkorten tot 2 dagen. Er werd waargenomen dat een incubatietijd van 2 of 3 dagen voldoende is om een infectie mogelijk te maken die resulteert in scheutinitialen. Langere incubatietijden worden echter niet aanbevolen, omdat werd waargenomen dat de afwezigheid van een antibioticaremmer in de media vaak resulteert in overgroei van A. tumefaciens , die het opkomende weefsel kan doden.
Een beperking van deze studie is het gebrek aan beschikbare gegevens over de prestaties van andere methoden of soorten van A. tumefaciens in P. lanceolata-transformatie ter vergelijking. Voor zover wij weten is dit protocol nieuw. Tijdens de eerste proeven werd een hoge transformatie-efficiëntie opgemerkt met A. tumefaciens GV3101, en we concentreerden ons op het verfijnen van de techniek met behulp van deze stam in plaats van te experimenteren met andere stammen. Onze transformatie-efficiëntie van 20% is relatief hoog voor planttransformatie - veel conventionele methoden beschouwen alles >1% als succesvol26,27,28. Het gebruik van een andere stam van A. tumefaciens, zoals A. rhizogenes, bekend om zijn gebruik bij worteltransformatie bij meerdere soorten 29,30,31, kan echter resulteren in een nog hoger slagingspercentage. Verdere experimenten zouden nodig zijn om de impact te beoordelen van het gebruik van andere stammen om een verhoogde transformatie-efficiëntie in P. lanceolata te bevorderen.
De succesvolle transformatie van P. lanceolata zal waarschijnlijk veel studiegebieden ten goede komen. De hoge transformatie-efficiëntie en de snelle groei van de plant in weefselkweekmedia maken P. lanceolata een haalbare kandidaat voor genfunctiestudies15.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 tot C.Z. en Y.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 | ThermoFisher Scientific | 150268 | |
| 1-Naphthylacetic acid | Gold Biotechnology | N-780 | |
| 3M Micropore Surgical Paper Tape | ThermoFisher Scientific | 19-027761 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Research Products International Corp. | 163227LC | |
| 600 Watt High Pressure Sodium Lights | Plantmax | PX-LU600 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BAP) | Gold Biotechnology | B-110 | |
| Aluminum Foil | ThermoFisher Scientific | 01-213-100 | |
| Bacto Agar | Thermofisher Scientific | 214010 | |
| Binary Plasmid pBI101 | Clontech, USA | 632522 | |
| Cool White Grow Light Sylvania LLC | Home Depot | 315952205 | |
| D-biotin | ThermoFisher Scientific | BP232-1 | |
| ddH2O | |||
| DH5a E. coli | Invitrogen, USA | 18258012 | |
| Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875714G | |
| Dissecting Scissors | Leica Biosystems | 38DI12044 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705 | |
| Folic Acid | Fisher Scientific | BP2519-5 | |
| Forceps | Leica Biosystems | 38DI18031 | |
| Gelrite | Research Products International Corp. | G35020-1000 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | 17904 | |
| Glycine | Sigma | 241261 | |
| Incubated Tabletop Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | SHKE420HP | |
| Indole-3-Acetic Acid (IAA) | Gold Biotechnology | I-110 | |
| Indole-3-Butyric Acid (IBA) | Gold Biotechnology | I-180 | |
| Kanamycin Monosulfate | Gold Biotechnology | K-120 | |
| Macrocentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Magenta Boxes | ThermoFisher Scientific | 50255176 | |
| Micro Pipet Tips 1000 µL | Corning | 4140 | |
| Micro Pipet Tips 200 µL | Corning | 4138 | |
| Micro Pipette Tips 10 µL | Corning | 4135 | |
| Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002410 | |
| Micropipettor 0.5-10 µL | Corning | 4071 | |
| Micropipettor 100-1000 µL | Corning | 4075 | |
| Micropipettor 20-200 µL | Corning | 4074 | |
| Micropipettor 2-20 µL | Corning | 4072 | |
| Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins | PhytoTech | M519 | |
| Murashige & Skooge Basal Salt Mixture | PhytoTech | M524 | |
| myo-Inositol | Gold Biotechnology | I-25 | |
| Nicotinic acid | Sigma | N0761-100g | |
| Parafilm (paraffin film) | ThermoFisher Scientific | S37440 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Research Products International Corp. | P44000 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P6280-10g | |
| Scalpel Blade Handle | Leica Biosystems | 38DI36419 | |
| Scalpel Blades | Leica Biosystems | 3802181 | |
| Sodium Chloride, Crystal (NaCl) | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Research Products International Corp. | S24000 | |
| Sodium Hypochlorite | Walmart | 23263068401 | |
| Soil- Bark Mix | Berger, USA | BM7 | |
| Square Pots (3.5 inches squared) | Greenhouse Megastore | CN-TRK-1835 | |
| Sucrose | Research Products International Corp. | S24060 | |
| Thermocycler | ThermoFisher Scientific | A24811 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T4625-5G | |
| Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) | Gold Biotechnology | T-104 | |
| trans-Zeatin Riboside (ZR) | Gold Biotechnology | Z-100 | |
| Tryptone | Thermofisher Scientific | 211705 | |
| Wild Type Plantago lanceolata seeds | Outsidepride Seed Source, OR, USA | F1296 | Outsidepride.com |
| Yeast Extract Granulated | Research Products International Corp. | Y20025-1000 |
References
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. The Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Bragg, J. N., Anderton, A., Nieu, R., Vogel, J. P. Brachypodium distachyon. Agrobacterium Protocols. , Springer. New York, NY. 17-33 (2015).
- Chang, C., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Field guide to plant model systems. Cell. 167 (2), 325-339 (2016).
- Müller, B., Grossniklaus, U.
- Ding, X., et al. Different fruit-specific promoters drive AtMYB12 expression to improve phenylpropanoid accumulation in tomato. Molecules. 27 (1), 317 (2022).
- Niedbała, G., Niazian, M., Sabbatini, P. Modeling agrobacterium-mediated gene transformation of tobacco (Nicotiana tabacum)-a model plant for gene transformation studies. Frontiers in Plant Science. 12, 695110 (2021).
- Kumari, D., Prasad, B., Dwivedi, P. Genome Editing Platforms in Rice (Oryza sativa L.): Basic methodology and troubleshooting. , (2022).
- Zhang, B. Agrobacterium-mediated transformation of cotton. Transgenic Cotton. , Humana Press. Totowa, NJ. 31-45 (2013).
- Tiwari, R., Singh, A. K., Rajam, M. V. Improved and reliable plant regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation in soybean (Glycine max L). Journal of Crop Science and Biotechnology. , 1-10 (2022).
- Bakhsh, A. Development of efficient, reproducible and stable Agrobacterium-mediated genetic transformation of five potato cultivars. Food Technology and Biotechnology. 58 (1), 57-63 (2020).
- Bates, R., Craze, M., Wallington, E. J. Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape (Brassica napus). Current Protocols in Plant Biology. 2 (4), 287-298 (2017).
- Hopp, H. E., Spangenberg, G., Herrera-Estrella, L.
- Abdelmuhsin, A. A., Alghamdi, A. A., Ibrahim, N. A. Assessing the phenotypic and genotypic variations of Plantago ciliata in Ha'il region, Saudi Arabia. Entomology and Applied Science Letters. (1), 14-22 (2021).
- Coleman, N.
- Huang, J., et al. Tissue-specific transcriptomic profiling of Plantago major provides insights for the involvement of vasculature in phosphate deficiency responses. Molecular Genetics and Genomics. 294 (1), 159-175 (2019).
- Penczykowski, R. M., Sieg, R. D. Plantago spp. as models for studying the ecology and evolution of species interactions across environmental gradients. The American Naturalist. 198 (1), 158-176 (2021).
- Pommerrenig, B., et al. Common plantain. A collection of expressed sequence tags from vascular tissue and a simple and efficient transformation method. Plant Physiology. 142 (4), 1427-1441 (2006).
- Bergero, R., Levsen, N., Wolff, K., Charlesworth, D. Arms races with mitochondrial genome soft sweeps in a gynodioecious plant, Plantago lanceolata. Molecular Ecology. 28 (11), 2772-2785 (2019).
- Aalto, E. A., Koelewijn, H. P., Savolainen, O. Cytoplasmic male sterility contributes to hybrid incompatibility between subspecies of Arabidopsis lyrata. G3: Genes, Genomes, Genetics. 3 (10), 1727-1740 (2013).
- Bloch, K. D., Grossmann, B. Digestion of DNA with restriction endonucleases. Current Protocols in Molecular Biology. 3 (1), (1995).
- Du, C., et al. Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber. International Journal of Biological Macromolecules. 194, 395-401 (2022).
- Deshmukh, S. 22, Kulkarni, R., Bose, K. Transformation and protein expression. Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins. , Springer. Singapore. 83-114 (2022).
- Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, Academic Press. 299-309 (2013).
- Broehan, G., Kroeger, T., Lorenzen, M., Merzendorfer, H. Functional analysis of the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene family of Tribolium castaneum. BMC Genomics. 14, 6 (2013).
- Dong, Z., et al. Stable transformation of fluorescent proteins into Nosema bombycis by electroporation. Parasites & Vectors. 15 (1), 141 (2022).
- Li, S., et al.
- Manimaran, P., et al. Infection of early and young callus tissues of indica rice BPT 5204 enhances regeneration and transformation efficiency. Rice Science. 20 (6), 415-426 (2013).
- Wang, J., Nie, J., Pattanaik, S., Yuan, L. Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Artemisia annua L. using young inflorescence. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 52 (2), 204-211 (2016).
- Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
- Geng, S., et al. An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9-based analyses of shoot-root communication in cucurbit crops. Horticulture Research. 9, (2022).
- Xiao, Y., et al. Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation using cotyledons, hypocotyls and roots of 'Duli'(Pyrus betulifolia Bunge). Scientia Horticulturae. 296, 110906 (2022).
