Visualisatie van vroege infectieplaatsen van rijstontploffingsziekte (Magnaporthe oryzae) op gerst (Hordeum vulgare) met behulp van een basismicroscoop en een smartphone
Summary
Dit is een eenvoudig protocol van een gerstbladschedetest met minimale reagentia en gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur (inclusief een basissmartphone). Het doel is om het vroege infectieproces van blastziekte in laboratoria te visualiseren zonder toegang tot geavanceerde microscopieapparatuur.
Abstract
Begrijpen hoe planten en ziekteverwekkers op elkaar inwerken, en of die interactie culmineert in afweer of ziekte, is nodig om sterkere en duurzamere strategieën voor de gezondheid van planten te ontwikkelen. Vooruitgang in methoden die plantenpathogene monsters effectiever in beeld brengen tijdens infectie en kolonisatie heeft hulpmiddelen opgeleverd zoals de rijstbladschedetest, die nuttig is geweest bij het monitoren van infecties en vroege kolonisatiegebeurtenissen tussen rijst en de schimmelpathogeen, Magnaporthe oryzae. Deze hemi-biotrofe ziekteverwekker veroorzaakt ernstig ziekteverlies in rijst en gerelateerde eenzaadlobbigen, waaronder gierst, rogge, gerst en meer recent tarwe. De bladschedetest levert, indien correct uitgevoerd, een optisch helder plantengedeelte op, meerdere lagen dik, waardoor onderzoekers live-cell beeldvorming kunnen uitvoeren tijdens een pathogeenaanval of vaste monsters kunnen genereren die zijn gekleurd voor specifieke kenmerken. Gedetailleerd cellulair onderzoek naar de gerst-M. oryzae interactie is achtergebleven bij die van de rijstgastheer, ondanks het groeiende belang van dit graan als voedselbron voor dieren en mensen en als gefermenteerde dranken. Hier wordt de ontwikkeling van een gerstebladschedetest gemeld voor ingewikkelde studies van M. oryzae-interacties tijdens de eerste 48 uur na inenting. De bladschedetest, ongeacht welke soort wordt bestudeerd, is delicaat; Er is een protocol dat alles omvat, van gerstgroeiomstandigheden en het verkrijgen van een bladschede, tot inenting, incubatie en beeldvorming van de ziekteverwekker op plantenbladeren. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd voor high-throughput screening met behulp van zoiets eenvoudigs als een smartphone voor beeldvormingsdoeleinden.
Introduction
Magnaporthe oryzae, de rijststraalschimmel, infecteert een assortiment graangewassen, waaronder gerst, tarwe en rijst1. Deze ziekteverwekker veroorzaakt verwoestende ziekten en vormt een wereldwijde bedreiging voor deze waardevolle gewassen, waardoor het gewas volledig verloren gaat als het niet wordt gecontroleerd. Veel laboratoria over de hele wereld richten zich op rijstblastziekte vanwege de wereldwijde dreiging en de kenmerken ervan als een uitstekend model voor plant-schimmelinteracties2. Het is volledig gesequenced en de genetica van de infectieuze cyclus, met name de vroege gebeurtenissen, zijn vastgesteld 3,4. De levenscyclus begint met een spore die ontkiemt op een bladoppervlak en de gespecialiseerde penetratiestructuur vormt die het appressorium wordt genoemd. Het appressorium dringt het bladweefsel binnen en de infectie gaat verder met de ontwikkeling van laesies die het proces van sporulatie starten en ziekte verspreiden4. Het voorkomen van een van deze vroege gebeurtenissen zou deze verwoestende ziekte drastisch remmen. Daarom is het meeste huidige onderzoek naar blastziekte gericht op de vroege infectiestappen, van de gekiemde conidia die een appressorium vormen tot de ontwikkeling van de invasieve schimmeldraden en het biotrofe interfaciale complex (BIC)5.
De enorme hoeveelheid onderzoek naar blastziekte is uitgevoerd in rijst, hoewel M. oryzae een belangrijke ziekteverwekker is voor een verscheidenheid aan gewassen, en nieuw geëvolueerde stammen opkomen als een wereldwijde bedreiging voor tarwe6. Terwijl rijst een van de top drie basisgewassen is die worden gebruikt om de bevolking te voeden, samen met tarwe en maïs, is gerst de vierde graankorrel in termen van veevoer en bierproductie7. Naarmate de ambachtelijke bierindustrie groeit, groeit ook de economische waarde van gerst. Er zijn duidelijke voordelen van het gebruik van M. oryzae en gerst als een pathosysteem om blastziekte te bestuderen. Ten eerste zijn er stammen van M. oryzae die alleen gerst infecteren, evenals stammen die meerdere grassoorten kunnen infecteren. 4091-5-8 infecteert bijvoorbeeld voornamelijk alleen gerst, terwijl Guy11 en 70-15 zowel gerst als rijst8 kunnen infecteren. Deze stammen zijn genetisch vergelijkbaar en het infectieproces is vergelijkbaar9. Ten tweede is gerst onder standaard laboratorium- en kasomstandigheden gemakkelijker te kweken, omdat het niet de gecompliceerde vereisten van rijst heeft (beknopte temperatuurregeling, hoge luchtvochtigheid, specifieke lichtspectra). Er zijn ook beeldvormingsuitdagingen met rijst vanwege de hydrofobiciteit van het bladoppervlak, die gerst niet vertoont10.
Dit protocol presenteert een eenvoudige methode voor het isoleren en effectief gebruiken van gerstbladscheden voor microscopische analyse van meerdere infectiestadia, met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumbenodigdheden en een smartphone voor gegevensverzameling. Deze methode voor de gerstbladschedetest is aanpasbaar voor laboratoria over de hele wereld, omdat het minimale voorraden vereist en toch een duidelijk beeld geeft van de microscopische interactie tussen de ziekteverwekker en de eerste paar cellen die het infecteert. Terwijl pathogeniciteitstests, zoals een spray of druppelinenting, een macrobeeld kunnen geven van het vermogen van de ziekteverwekker om laesies te vormen, stelt deze test de onderzoeker in staat om specifieke stappen van vroege infectie te visualiseren, van pre-penetratiegebeurtenissen tot kolonisatie van epidermale cellen. Verder kunnen onderzoekers infectie met de wild-type schimmel gemakkelijk vergelijken met infectie met een mutant verminderd in virulentie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn veel veelgebruikte assays beschikbaar om M. oryzae-stammen te testen die een macroscopisch beeld geven van een compatibele of incompatibele infectierespons, zoals spray- of druppelinentingen, en het gebruik van beoordelingssystemen om laesiegroottes13,14 te kwantificeren. Een andere veel voorkomende test voor M. oryzae is het testen van het vermogen van de ziekteverwekker om zijn gespecialiseerde penetratiestructuur, het apppressorium<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen financiering van de USDA-NIFA award 2016-67013-24816.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
