Visualisation des sites d’infection précoce de la maladie du souffle du riz (Magnaporthe oryzae) sur l’orge (Hordeum vulgare) à l’aide d’un microscope de base et d’un smartphone

Summary

Il s’agit d’un protocole simple d’essai de gaine de feuilles d’orge utilisant un minimum de réactifs et un équipement de laboratoire commun (y compris un smartphone de base). L’objectif est de visualiser le processus d’infection précoce de la maladie blastique dans des laboratoires sans accès à un équipement de microscopie avancé.

Abstract

Comprendre comment les plantes et les agents pathogènes interagissent, et si cette interaction aboutit à la défense ou à la maladie, est nécessaire pour développer des stratégies plus solides et plus durables pour la santé des plantes. Les progrès des méthodes qui permettent d’imager plus efficacement les échantillons d’agents phytopathogènes pendant l’infection et la colonisation ont donné lieu à des outils tels que le test de la gaine de feuille de riz, qui a été utile pour surveiller l’infection et les événements de colonisation précoce entre le riz et l’agent pathogène fongique, Magnaporthe oryzae. Cet agent pathogène hémi-biotrophe provoque de graves pertes de maladies dans le riz et les monocotylédones apparentées, y compris le mil, le seigle, l’orge et, plus récemment, le blé. Le test de la gaine foliaire, lorsqu’il est effectué correctement, donne une section de plante optiquement claire, plusieurs couches d’épaisseur, ce qui permet aux chercheurs d’effectuer une imagerie de cellules vivantes lors d’une attaque pathogène ou de générer des échantillons fixes colorés pour des caractéristiques spécifiques. Les études cellulaires détaillées sur l’interaction orge-M. oryzae ont pris du retard par rapport à celles de l’hôte du riz, malgré l’importance croissante de cette céréale comme source de nourriture pour les animaux et les humains et comme boissons fermentées. Il est rapporté ici le développement d’un test de gaine de feuilles d’orge pour des études complexes des interactions de M. oryzae au cours des 48 premières heures suivant l’inoculation. Le dosage de la gaine foliaire, quelle que soit l’espèce étudiée, est délicat; Un protocole qui couvre tout, des conditions de croissance de l’orge à l’obtention d’une gaine foliaire, en passant par l’inoculation, l’incubation et l’imagerie de l’agent pathogène sur les feuilles des plantes. Ce protocole peut être optimisé pour le dépistage à haut débit en utilisant quelque chose d’aussi simple qu’un smartphone à des fins d’imagerie.

Introduction

Magnaporthe oryzae, le champignon de l’explosion du riz, infecte un assortiment de cultures céréalières, y compris l’orge, le blé et le riz¹. Cet agent pathogène provoque des maladies dévastatrices et constitue une menace mondiale pour ces cultures précieuses, causant une perte complète de récoltes si elle n’est pas contrôlée. De nombreux laboratoires à travers le monde se concentrent sur la maladie du riz en raison de sa menace mondiale et de ses attributs en tant qu’excellent modèle pour les interactions plantes-champignons². Il a été entièrement séquencé et la génétique de son cycle infectieux, en particulier....

Protocol

1. Préparation du matériel expérimental

1. Préparer la gélose à l’avoine (OMA) en mélangeant la farine d’avoine jusqu’à ce qu’elle soit une poudre fine. Ajouter 25 g de poudre d’avoine et 15 g de gélose à 500 mL de_ddH2O, et autoclaver sur le cycle du média (ou porter à ébullition pendant 20 min). Versez le média dans des boîtes de Petri stériles de 60 mm.
   REMARQUE: D’autres types de supports qui induisent la sporulation, tels que la gélose V8, sont acceptables pour ce protocole.
2. La plaque M. oryzae filtre les stocks directement sur les plaques OMA à l’aide de pinces stériles et leur permet de couvrir toute la pl....

Results

Une représentation du flux de travail initial pour cette technique est illustrée à la figure 1. Les gaines ont été récoltées sur des plants d’orge sensibles de 14 jours (H. vulgare). Les conidies ont été récoltées sur des plaques d’OMA sporulantes de M. oryzae âgées de 10 jours, avec une suspension conidiale préparée à l’aide de ddH₂O stérile pour une concentration finale de 5 x 10⁴ spores par mL. La suspension d’inoculum a été appliquée directement su.......

Discussion

Il existe de nombreux tests couramment utilisés pour tester les souches de M. oryzae qui fournissent un visuel macroscopique d’une réponse à une infection compatible ou incompatible, tels que les inoculations par pulvérisation ou gouttelettes, et l’utilisation de systèmes d’évaluation pour quantifier les tailles de lésion^13,14. Un autre test courant pour M. oryzae consiste à tester la capacité de l’agent pathogène à former sa structure de pénétr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide acétique	Sigma-Aldrich	A6283
Téléphone portable  ;	Google  ;	Pixel 4A	N’importe quel smartphone doté d’une caméra arrière pouvant être montée dans un support suffira.  ;
Adaptateur de microscope pour téléphone portable	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+ %2Caps %2C63& sr=8-2 -spons& psc=1& spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQQ. md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x&ndash ; 2500x Microscope d’épi-fluorescence droit trinoculaire
Flocons d’avoine à l’ancienne	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& hvptwo=& hvq mt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& hvtargid =pla-568492637928& psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Verre de protection rectangulaire	Corning	CLS2975245
Lames, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Micromètre de platine  ;	OMAX	A36CALM7	0,1 mm et 0,01 mm Lame d’étalonnage du microscope
Trypan bleu	Sigma-Aldrich	T6146