Jelatin Metakriloil Granül Hidrojel İskeleleri: Yüksek Verimli Mikrojel İmalatı, Liyofilizasyon, Kimyasal Montaj ve 3D Biyobaskı
Summary
Bu makalede, mikroakışkan cihazlar kullanılarak yüksek verimli jelatin metakriloil mikrojel üretimi, mikrojellerin yeniden askıya alınabilir toza (mikro-aerojeller) dönüştürülmesi, granüler hidrojel iskeleleri oluşturmak için mikrojellerin kimyasal montajı ve 3D biyobaskı için korunmuş mikroporoziteye sahip granüler hidrojel biyomürekkeplerinin geliştirilmesi için protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Hidrojel mikropartiküllerinin (HMP’ler) birleştirilmesiyle üretilen granüler hidrojel iskelelerin (GHS) ortaya çıkması, mikro gözenekli iskele oluşumunu in situ olarak sağlamıştır. Geleneksel dökme hidrojellerin aksine, GHS’deki birbirine bağlı mikro ölçekli gözenekler, bozunmadan bağımsız hücre infiltrasyonunun yanı sıra oksijen, besin ve hücresel yan ürün transferini kolaylaştırır. Metakriloil-modifiye jelatin (GelMA), hücre yapıştırıcısı ve biyolojik olarak parçalanabilir moieties içeren (fotoğraf) kimyasal olarak çapraz bağlanabilen, protein bazlı bir biyopolimer, hücreye duyarlı / öğretici bir biyomateryal olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Toplu GelMA’yı GHS’ye dönüştürmek, doku mühendisliği ve rejenerasyonu için çok sayıda fırsat yaratabilir. Bu makalede, yüksek verimli GelMA mikrojel üretimi, yeniden askıya alınabilir kuru mikrojellere (mikro-aerojeller) dönüştürme, mikrojellerin kimyasal montajı yoluyla GHS oluşumu ve ekstrüzyon biyobaskısı için granüler biyomürekkep üretimi prosedürlerini göstereceğiz. Soğutma ve fotoçapraz bağlama yoluyla sıralı bir fizikokimyasal işlemin mekanik olarak sağlam GHS’nin oluşumunu nasıl sağladığını gösteriyoruz. Işığa erişilemediğinde (örneğin, derin doku enjeksiyonu sırasında), ayrı ayrı çapraz bağlı GelMA HMP’ler, transglutaminazlar kullanılarak enzimatik çapraz bağlama yoluyla biyoortogonal olarak birleştirilebilir. Son olarak, düşük HMP paketleme yoğunluğunda mikrogözenekli GHS’nin üç boyutlu (3D) biyobaskısı, heterojen olarak yüklü nanopartiküllerin ara yüzey kendi kendine montajı yoluyla gösterilmiştir.
Introduction
Doku mühendisliği iskeleleri oluşturmak için HMP yapı taşlarının montajı son birkaç yılda büyük ilgi görmüştür1. HMP montajı ile üretilen GHS, ayrık yapı taşları arasındaki boşluk boşluklarından kaynaklanan hücre ölçeğinde mikro gözeneklilik de dahil olmak üzere, toplu muadilleriyle karşılaştırıldığında benzersiz özelliklere sahiptir. Enjekte edilebilirlik, modülerlik ve gözeneklilikten ayrılmış sertlik gibi ek özellikler, GHS’yi doku onarımını ve yenilenmesini geliştirmek için umut verici bir platform haline getirir2. GHS üretimi için sentetik PEG bazlı polimerler3,4 ve aljinat5 ve hyaluronik asit 6,7 gibi polisakkaritler dahil olmak üzere farklı biyomalzemeler kullanılmıştır. Doğal olarak türetilmiş polimerler arasında, GHS üretimi için en yaygın protein bazlı biyopolimer, çapraz bağlanabilir, biyouyumlu, biyoyapıştırıcı ve biyolojik olarak parçalanabilir bir biyomalzeme olan GelMA 8,9,10,11’dir 12,13.
HMP’ler, toplu emülsifikasyon8, akış odaklı 14,15 veya adım emülsifikasyon 9,11 mikroakışkan cihazlar,harmanlama 16 veya karmaşık koapervasyon17,18 yoluyla üretilebilir. Genellikle, imalat verimi ile HMP monodispersitesi arasında bir denge vardır. Örneğin, karıştırma tekniği düzensiz şekilli ve yüksek oranda polidağılmış HMP’ler verir. Toplu emülsifikasyon veya karmaşık koaservasyon, büyük hacimlerde çok dağınık küresel HMP’lerin üretilmesini sağlar. Akış odaklı mikroakışkan cihazlar,% <5'lik bir varyasyon katsayısına sahip yüksek oranda monodisperse damlacıklar üretmek için kullanılmıştır, ancak verim önemli ölçüde düşüktür. Kademeli emülsifikasyon mikroakışkan cihazlarda, yüksek oranda paralelleştirilmiş adımlar, monodisperse HMP'lerin19’unun yüksek verimli imalatını sağlar.
Metakriloil modifiye jelatin (GelMA) HMP yapı taşları ısıya duyarlı ve (fotoğraf) kimyasal olarak çapraz bağlanabilir, bu da kolay GHS üretimisağlar 20. Üst kritik çözelti sıcaklığının (UCST)21 altında soğutulduktan sonra (örneğin, 4 °C’de), bir GelMA çözeltisi içeren damlacıklar fiziksel olarak çapraz bağlı HMP’lere dönüştürülür. Bu HMP yapı taşları daha sonra sıkışmış mikrojel süspansiyonları elde etmek için dış kuvvetler (örneğin, santrifüjleme yoluyla) kullanılarak paketlenir. Parçacıklar arası bağlantılar, mekanik olarak sağlam GHS14’ü oluşturmak için bitişik HMP’ler arasında (fotoğraf) kimyasal çapraz bağlama yoluyla kurulur. GHS’nin en önemli özelliklerinden biri, in vitro11 facile hücre penetrasyonunu ve in vivo22’de gelişmiş doku büyümesini sağlayan mikro gözenekliliktir. HMP’lerin üç boyutlu (3D) biyobaskısı, geleneksel olarak sıkıca paketlenmiş mikrojel süspansiyonları kullanılarak gerçekleştirilir ve mikroporoziteden ödün verir23.
Son zamanlarda, heterojen olarak yüklü nanopartiküllerin adsorpsiyonu yoluyla GelMA mikrojellerinin ara yüz nanomühendisliğine dayanan yeni bir granüler biyomürekkep sınıfı geliştirdik, ardından nanopartikül geri dönüşümlü kendi kendine montaj. Bu strateji, gevşek bir şekilde paketlenmiş mikrojelleri kesme verimli ve ekstrüzyon 3D biyo-yazdırılabilir hale getirir, bu da eklemeli olarak üretilen GHS11’in mikro ölçekli gözenekliliğini korur. Bu makalede, yüksek verimli GelMA damlacık üretimi, bu damlacıkların fiziksel olarak çapraz bağlı HMP’lere dönüştürülmesi, yeniden askıya alınabilir toz kullanılarak GelMA HMP’lerin üretilmesi, GelMA GHS oluşumu, GelMA nanomühendislik granüler biyomürekkep (NGB) hazırlığı ve 3D biyobaskı yöntemleri sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jelatin ve türevleri, HMP üretimi için en yaygın kullanılan protein bazlı biyomalzemelerdir. Verim ve partikül boyutu monodispersite dengesi zorluğu, kademeli emülsifikasyon mikroakışkan cihazları kullanılarak aşılabilir. Bu cihazlar saatte 40 milyondan fazla damlacık oluşturabilir ve varyasyon katsayısı %5’ten az27’dir. Bu makalede, GelMA çözeltileri içeren damlacıkların mikrofabrikasyonunu tartıştık ve ardından bunları GelMA HMP’lere, toza, GHS’ye ve NGB’ye dönüşt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi (Penn State) Kimya Mühendisliği Bölümü’nde araştırma destek uzmanı olan T. Pond’a, Penn State’teki Nanofabrikasyon Laboratuvarı personeline ve Partillion Bioscience’dan Dr. J. de Rutte’ye nanofabrikasyon süreçleriyle ilgili yardım ve tartışmalar için teşekkür eder. A. Sheikhi, Malzeme Araştırma Enstitüsü (MRI) ve İnsan Düzeyinde Mühendislik Malzemeleri Önemlidir Koleji’nin tohum hibelerini, Yaşayan Çok İşlevli Malzeme Sistemleri için Yakınsama Merkezi’nin (LiMC2) ve Mükemmellik Kümesi Yaşayan, Uyarlanabilir ve Enerji-Otonom Malzeme Sistemleri (livMatS) Yaşayan Çok İşlevli Malzemeler İşbirlikçi Araştırma Tohum Hibe Programı’nın ve Penn State’in başlangıç fonunun desteğini kabul eder. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin (NIH) Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü (NIBIB) tarafından R56EB032672 ödül numarası altında kısmen desteklenmiştir.
Materials
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
| Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
| Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
| Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
| Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
| Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
| Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
| Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
| Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
| Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
| Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
| Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
| Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
| Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
| Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
| Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
| Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
| Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
| Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
| Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
| Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
| Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |
References
- Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 18 (36), 2201115 (2022).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication. Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).
- Zoratto, N., et al. In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering. Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).
- Yuan, Z., et al. In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care. Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).
- Ataie, Z., et al. Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting. Small. 18 (37), 2202390 (2022).
- Annabi, N., et al. 25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Rajabi, N., et al. Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair. Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization. MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).
- Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3d printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Claaßen, C., et al. Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls. Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , (2022).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules. ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).
- Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. Mechanical reinforcement of granular hydrogels. Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).
