Suportes de hidrogel granular de metacriloíla de gelatina: fabricação de microgel de alto rendimento, liofilização, montagem química e bioimpressão 3D
Summary
Este artigo descreve protocolos para a fabricação de microgel de metacriloíla de gelatina de alto rendimento usando dispositivos microfluídicos, conversão de microgéis em pó ressuspendível (micro-aerogéis), montagem química de microgéis para formar arcabouços de hidrogel granular e desenvolvimento de biotintas de hidrogel granulares com microporosidade preservada para bioimpressão 3D.
Abstract
O surgimento de arcabouços granulares de hidrogel (GHS), fabricados via montagem de micropartículas de hidrogel (HMPs), possibilitou a formação de arcabouços microporosos in situ. Ao contrário dos hidrogéis convencionais a granel, os poros de microescala interconectados no GHS facilitam a infiltração celular independente da degradação, bem como a transferência de oxigênio, nutrientes e subprodutos celulares. A gelatina modificada com metacriloíla (GelMA), um biopolímero (foto)quimicamente reticulável, à base de proteínas, contendo adesivo celular e metades biodegradáveis, tem sido amplamente utilizada como biomaterial responsivo/instrutivo a células. A conversão de GelMA em GHS em massa pode abrir uma infinidade de oportunidades para engenharia e regeneração de tecidos. Neste artigo, demonstramos os procedimentos de fabricação de microgel GelMA de alto rendimento, conversão em microgéis secos ressussuspendíveis (micro-aerogéis), formação de GHS através da montagem química de microgéis e fabricação de biotinta granular para bioimpressão por extrusão. Mostramos como um tratamento físico-químico sequencial via resfriamento e fotoreticulação permite a formação de GHS mecanicamente robusto. Quando a luz é inacessível (por exemplo, durante a injeção de tecidos profundos), HMPs de GelMA reticulados individualmente podem ser montados bioortogonalmente via reticulação enzimática usando transglutaminases. Finalmente, a bioimpressão tridimensional (3D) de GHS microporoso em baixa densidade de empacotamento de HMP é demonstrada através da automontagem interfacial de nanopartículas heterogêneamente carregadas.
Introduction
A montagem de blocos de construção HMP para formar arcabouços de engenharia de tecidos ganhou enorme atenção nos últimos anos1. GHS, fabricado via montagem HMP, tem propriedades únicas em comparação com suas contrapartes a granel, incluindo microporosidade em escala celular originada dos espaços vazios entre os blocos de construção discretos. Propriedades adicionais, como injetabilidade, modularidade e rigidez dissociada da porosidade, tornam o GHS uma plataforma promissora para melhorar o reparo e a regeneração tecidual2. Diferentes biomateriais têm sido utilizados para a fabricação de GHS, incluindo polímeros sintéticos à base de PEG3,4 e polissacarídeos, como alginato5 e ácido hialurônico 6,7. Dentre os polímeros naturalmente derivados, o biopolímero proteico mais comum para a fabricação de GHS é o GelMA 8,9,10,11, um biomaterial reticulável, biocompatível, bioadesivo e biodegradável 12,13.
As HMPs podem ser fabricadas através de dispositivos microfluídicos de emulsificação em batelada8, focalização de fluxo 14,15 ou emulsificação em passo9,11, mistura 16 ou coacervação complexa17,18. Normalmente, há um trade-off entre o rendimento de fabricação e a monodispersidade do HMP. Por exemplo, a técnica de mistura produz HMPs de forma irregular e altamente polidispersas. A emulsificação em batelada ou coacervação complexa permite a produção de grandes volumes de HMPs esféricas polidispersas<. Em dispositivos microfluídicos de emulsificação em etapas, as etapas altamente paralelizadas permitem a fabricação de HMPs monodispersas19.
Os blocos de construção HMP de gelatina modificada com metacriloíla (GelMA) são termorresponsivos e (foto)quimicamente reticuláveis, permitindo a fácil fabricação de GHS20. Após o resfriamento abaixo da temperatura crítica superior da solução (UCST)21 (por exemplo, a 4 °C), gotículas contendo uma solução de GelMA são convertidas em HMPs reticuladas fisicamente. Esses blocos de construção HMP são então embalados usando forças externas (por exemplo, via centrifugação) para produzir suspensões de microgel emperradas. Ligações interparticuladas são estabelecidas entre HMPs adjacentes via reticulação (foto)química para formar GHS14 mecanicamente robusto. Uma das propriedades mais importantes do GHS é a microporosidade, permitindo fácil penetração celular in vitro11 e maior crescimento tecidual in vivo22. A bioimpressão tridimensional (3D) de HMPs é convencionalmente realizada utilizando suspensões de microgel bem embaladas, comprometendo a microporosidade23.
Recentemente, desenvolvemos uma nova classe de biotintas granulares baseada na nanoengenharia interfacial de microgéis GelMA via adsorção de nanopartículas heterogêneamente carregadas, seguida de automontagem reversível de nanopartículas. Essa estratégia torna os microgéis vagamente embalados produzindo cisalhamento e extrusão 3D bioimprimíveis, o que preserva a porosidade em microescala do GHS11 fabricado aditivamente. Este artigo apresenta os métodos para fabricação de gotículas de GelMA de alto rendimento, convertendo essas gotículas em HMPs fisicamente reticuladas, fabricando HMPs de GelMA usando pó ressuspendível, formação de GelMA GHS, preparação de biotinta granular nanoprojetada (NGB) de GelMA e bioimpressão 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
A gelatina e seus derivados são os biomateriais proteicos mais comumente utilizados para a fabricação de HMP. O desafio do trade-off de monodispersidade de produção versus tamanho de partícula pode ser superado usando dispositivos microfluídicos de emulsificação por etapas. Esses dispositivos são capazes de formar mais de 40 milhões de gotículas por hora, com coeficiente de variação inferior a 5%27. Neste artigo, discutimos a microfabricação de gotículas contendo soluções de Gel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a T. Pond, especialista em apoio à pesquisa do Departamento de Engenharia Química da Universidade Estadual da Pensilvânia (Penn State), à equipe do Laboratório de Nanofabricação da Penn State e ao Dr. J. de Rutte da Partillion Bioscience pela ajuda e discussão sobre os processos de nanofabricação. A. Sheikhi agradece o apoio do Materials Research Institute (MRI) e da College of Engineering Materials Matter at the Human Level seed grants, do Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) e do Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program, e do fundo de startups da Penn State. A pesquisa relatada nesta publicação foi parcialmente apoiada pelo Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia (NIBIB) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o número de prêmio R56EB032672.
Materials
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
| Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
| Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
| Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
| Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
| Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
| Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
| Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
| Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
| Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
| Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
| Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
| Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
| Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
| Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
| Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
| Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
| Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
| Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
| Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
| Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
| Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |
References
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