Summary
Wir beschreiben eine einfache und effiziente Methode zur Isolierung von Zellen der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen. Dieses Verfahren ermöglicht molekularbiologische Folgeuntersuchungen am isolierten RPE, einschließlich Genexpressionsanalysen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen für eine mögliche Anwendung in molekularbiologischen Studien, einschließlich Genexpressionsanalysen. Im Zusammenhang mit der Regulation des Augenwachstums und der Myopie spielt das RPE wahrscheinlich eine Rolle als zelluläres Relais für wachstumsmodulatorische Signale, da es sich zwischen der Netzhaut und den beiden Wänden des Auges, wie der Aderhaut und der Sklera, befindet. Während Protokolle zur Isolierung des RPE sowohl für Küken als auch für Mäuse entwickelt wurden, haben sich diese Protokolle als nicht direkt auf das Meerschweinchen übertragbar erwiesen, das zu einem wichtigen und weit verbreiteten Myopiemodell für Säugetiere geworden ist. In dieser Studie wurden molekularbiologische Werkzeuge verwendet, um die Expression bestimmter Gene zu untersuchen, um zu bestätigen, dass die Proben frei von Verunreinigungen aus den angrenzenden Geweben waren. Der Wert dieses Protokolls wurde bereits in einer RNA-Seq-Studie zu RPE von jungen pigmentierten Meerschweinchen nachgewiesen, die einer Myopie-induzierenden optischen Defokussierung ausgesetzt waren. Neben der Regulierung des Augenwachstums hat dieses Protokoll weitere potenzielle Anwendungen in Studien zu Netzhauterkrankungen, einschließlich der myopischen Makulopathie, einer der Hauptursachen für Erblindung bei Myopen, an der das RPE beteiligt ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie relativ einfach ist und nach ihrer Perfektionierung qualitativ hochwertige RPE-Proben liefert, die für molekularbiologische Studien, einschließlich RNA-Analysen, geeignet sind.
Introduction
Das RPE besteht aus einer einzigartigen Monoschicht pigmentierter Zellen, die sich zwischen der neuralen Netzhaut und der vaskulären Aderhaut befinden, und die RPE spielt eine anerkannte Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung einer normalen Netzhautfunktion, einschließlich der Phototransduktion 1,2. In jüngerer Zeit wurde dem RPE eine zusätzliche Schlüsselrolle bei der Regulation des Augenwachstums3 und damit bei der Entwicklung von Myopie4 zugewiesen. Diese Zuordnung basiert auf der kritischen Lokalisation des RPE, die zwischen Netzhaut und Aderhaut liegt, und der mittlerweile weit verbreiteten Akzeptanz, dass das Augenwachstum und damit die Brechungsfehler lokal reguliert werden5. Es wird angenommen, dass das RPE eine Schlüsselrolle als Signalrelais spielt, das die Netzhaut, die angenommene Quelle wachstumsmodulatorischer Signale, mit der Aderhaut und der Sklera, den beiden Zielen der weitergeleiteten Signale 6,7,8, verbindet.
Die Zunahme der axialen Länge, die für die meisten Myopien charakteristisch ist, kann nicht als gutartig angesehen werden, wobei pathophysiologische Veränderungen der Netzhaut, der Aderhaut und/oder der Sklera unvermeidliche und inzwischen allgemein anerkannte Folgen einer übermäßigen Augendehnung darstellen 7,9. In diesem Zusammenhang ist das RPE vielleicht am anfälligsten, da es als nichtmitotisches Gewebe nur durch Dehnung und Ausdünnung einzelner Zellen in der Lage ist, die expandierende Glaskörperkammer aufzunehmen. Während seine Rolle bei Myopie-bedingten Pathologien, wie der myopischen Makuladegeneration, noch nicht vollständig verstanden ist, wurde das RPE in die Pathogenese einer Reihe anderer Netzhauterkrankungen verwickelt, einschließlich der geografischen Atrophie, einer der Hauptursachen für Erblindung, die mit dokumentierten Anomalien in der Netzhaut, RPE und Aderhaut verbunden ist10,11, 12. Sonstiges
Die erfolgreiche Isolierung von RPE-Zellen, die frei von Verunreinigungen aus benachbarten Augengeweben sind, eröffnet potenziell viele Forschungsmöglichkeiten, um neue Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, die einer Vielzahl von Augen-/Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. Die Isolierung des RPE hat sich jedoch als schwierig erwiesen, da viele veröffentlichte Studien aus diesem Grund kombinierte Netzhaut/RPE- oder RPE/Aderhautproben verwenden13,14,15. Studien, die die erfolgreiche Isolierung des RPE in einer für molekularbiologische Studien geeigneten Qualität beinhalteten, beschränkten sich auf Küken- und Mäuseaugen16,17. Zum Beispiel die von Wang et al.18 beschriebene Methode der simultanen RPE-Isolierung und RNA-Stabilisierung (SRIRS). Die Isolierung von RPE-Zellen in Mäusen scheint in Meerschweinchenaugen nicht gut zu funktionieren. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine Verfeinerung eines Ansatzes dar, der ursprünglich von einem der Autoren (M.F.) mit Baumspitzmausaugen prototypisiert wurde und nachweislich qualitativ hochwertige RPE-Proben aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen liefert, die für RNA- und andere molekularbiologische Analysen geeignet sind19.
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Protocol
Alle Tierpflege- und -behandlungen, die in dieser Studie verwendet wurden, entsprachen der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Die Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of California, Berkeley, genehmigt.
1. Enukleation des Meerschweinchenauges
- Euthanasieren Sie ein Meerschweinchen mit einer intrakardialen Injektion von Natrium-Pentobarbital, das unter Narkose verabreicht wird (5% Isofluran in Sauerstoff).
- Entkernen Sie die Augen mit Hilfe einer Pinzette und einer Schere und geben Sie sie sofort zum Waschen in eine 10-cm-Petrischale mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Übertragen Sie die Augen auf frische PBS-Lösung.
HINWEIS: Eine 6-Well-Platte mit 4 ml Lösung pro Well wird empfohlen.
2. Isolierung der hinteren Augenmuschel und des RPE/Aderhaut/Sklera-Komplexes
- Verwenden Sie mit Hilfe eines Präpariermikroskops eine 18-G-Nadel, um einen ersten kleinen Schnitt in der Sklera zu machen, etwa 1,0 mm hinter der Limbusgrenze (d. h. zwischen Hornhaut und Sklera) (Abbildung 1A); Entfernen Sie dann mit einer Schere das vordere Segment, einschließlich der Hornhaut, der Iris, des Ziliarkörpers und der Augenlinse.
- Als nächstes lösen Sie mit der verbleibenden Augenmuschel des hinteren Augensegments die Netzhaut vom RPE / Aderhaut / Sklera-Komplex. Verwenden Sie eine Pinzette, um zuerst die Zonule von Zinn zu greifen und dann sanft daran zu ziehen und dann die Netzhaut schrittweise ohne Fragmentierung abzuziehen (Abbildung 1B).
HINWEIS: Die Netzhaut darf nicht direkt erfasst werden, um eine Fragmentierung der Netzhaut und eine unvollständige Isolierung des Netzhautgewebes zu vermeiden. Die Verwendung eines Mikroskops ist für diesen Dissektionsschritt unerlässlich.
3. Isolierung des RPE von der Aderhaut
- Nachdem die Netzhaut vollständig entfernt wurde, tauchen Sie die verbleibende hintere Augenmuschel, die das RPE, die Aderhaut und die Sklera enthält, 5 Minuten lang in ein Gewebespeicherreagenz ein (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Verwenden Sie eine 12-Well-Platte mit identifizierten Wells, die jeweils mit 2 ml des Gewebespeicherreagenzes gefüllt sind. - Übertragen Sie die Augenmuschel für 10 s in eine andere Vertiefung, die mit 4 ml PBS gefüllt ist, bevor Sie sie in eine dritte Vertiefung bringen, die mit 2 ml PBS gefüllt ist.
- Befestigen Sie eine 30-G-Nadel an einer mit PBS gefüllten 1-ml-Spritze für den letzten RPE-Isolationsschritt. Drücken Sie vorsichtig auf die Spritze, um einen Jetstream von PBS zu erzeugen; Richten Sie diesen Strom zuerst auf das RPE, um einen kleinen Riss oder ein Loch darin zu machen, und leiten Sie dann den Strom von PBS in die erzeugte Öffnung, um das RPE als Blatt von der Aderhaut zu lösen (Abbildung 1C).
HINWEIS: Die Ablösung des RPE als Blatt ergibt die größte RPE-Probe. Auch hier ist die Verwendung eines Mikroskops für diesen Schritt unerlässlich. - Nachdem Sie das RPE von der Aderhaut gelöst haben (Abbildung 1D), sammeln Sie das RPE-Gewebe in einer nadellosen 1-ml-Spritze und übertragen Sie die gesammelte Probe dann in ein 1,5-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie das 1,5-ml-Röhrchen mit dem gesammelten RPE bei 8.000 × g für 1 Minute, um ein RPE-Pellet zu erhalten (Abbildung 2A).
- Verwerfen Sie die PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch 350 ml Lysepuffer, wie sie in RNA-Isolationskits enthalten sind (siehe Materialtabelle). Pipettieren Sie 20x, um zu mischen und so die Qualität der Probe zu erhalten. Zur längerfristigen Lagerung und Konservierung werden die Proben in einen Gefrierschrank mit einer Temperatur von −80 °C überführt.
HINWEIS: Der Lysepuffer ist eine proprietäre Komponente des RNA-Isolationskits für die Zell- und Gewebelyse vor der RNA-Isolierung und der gleichzeitigen RNA/DNA/Protein-Isolierung. Um die RNAsen im Lysat zu inaktivieren, muss dem Lysepuffer unbedingt β-Mercaptoethanol zugesetzt werden (10 μl β-Mercaptoethanol pro 1 ml Lysepuffer).
4. RPE-RNA-Extraktion
- Verwenden Sie ein RNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle), um die RNA aus den RPE-Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers zu isolieren und zu sammeln. Bewerten Sie die Qualität der Probe mittels Elektrophorese.
HINWEIS: Das beschriebene Protokoll ergab ein qualitativ hochwertiges Produkt (d. h. RNA-Integritätszahl [RIN] über 8,0).
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Representative Results
Die Analyse der RPE-Proben, die mit dem obigen Protokoll gesammelt wurden, zeigte eine gut erhaltene RNA (RIN >8.0, Abbildung 2B) mit 240,2 ng ± 35,1 ng pro Auge (n = 8, NanoDrop, Abbildung 2B). Um die Qualität der isolierten RPE-Proben, insbesondere das Fehlen von Aderhaut- und Sklerakontaminanten, weiter zu bewerten, untersuchten wir die Expression repräsentativer Gene für jedes der letztgenannten Gewebe in den RPE-Proben19. Die RPE-Proben zeigten eine signifikant höhere Expression von Rpe65 (ein RPE-spezifisches Gen) im Vergleich zu den Rpe65-Expressionsniveaus in der Aderhaut und Sklera (Tabelle 1 und Abbildung 2C). Im Gegensatz dazu zeigten die RPE-Proben eine minimale Expression von Col1a1, dem ausgewählten Aderhaut-Sklera-spezifischen Gen (Abbildung 2D).
Abbildung 1: Verfahren zum Sammeln der RPE-Blätter . (A) Ein 2 Wochen altes Meerschweinchenauge mit dem ersten Schnitt. (B) Der vordere Augenabschnitt (Hornhaut, Iris und Linse), der Glaskörper und die Netzhaut werden dann von der hinteren Augenmuschel (RPE, Aderhaut und Sklera) getrennt. (C) Ein Jetstream von PBS, der über eine 30-G-Nadel abgegeben wird, wird verwendet, um das RPE (D) als Blatt (schwarze Pfeile) von der Aderhaut zu lösen. Der Eingriff vom ersten Schnitt bis zur RPE-Entnahme dauert 5-7 min. Abkürzung: RPE = retinales Pigmentepithel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Verfahren zur Beurteilung der Qualität der isolierten RPE-Proben. (A) Repräsentatives Bild einer RPE-Probe in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen nach dem Abschleudern. (B) Repräsentativer Bioanalysator-Output für RNA, die aus den gesammelten RPE-Proben extrahiert wurde. (C,D) Die Genexpressionsniveaus von Rpe65, einem RPE-spezifischen Gen, und Col1a1, das im RPE nicht oder nur minimal exprimiert wird, gemessen mittels RT-qPCR in den RPE-, Aderhaut- und Skleraproben von n = 3 unbehandelten Tieren; Beide Datensätze wurden auf β-Aktin normiert. ** P < 0,01; P < 0,001. Diese Zahl wurde gegenüber Goto et al.19 geändert. Abkürzungen: RPE = retinales Pigmentepithel; β-Aktin = Beta-Aktin; Col1a1 = Kollagen-Typ-I-Alpha-1-Kette; Rpe65 = Retinoid-Isomerohydrolase; RT-qPCR = quantitative Polymerase-Kettenreaktion mit reverser Transkription. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Gen | Vorwärts Primer (5' bis 3') | Reverse Primer (5' bis 3') | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| RPE65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-Aktin | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Tabelle 1: Nukleotidsequenzen der Primer, die für die PCR-Amplifikation in der Probenqualitätsanalyse verwendet werden. Abkürzungen: β-Aktin = Beta-Aktin; Col1a1 = Kollagen Typ I alpha 1 Kette; Rpe65 = Retinoid-Isomerohydrolase.
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Discussion
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von RPE, die für RPE-Genexpressionsanalysen geeignet ist, aus den Augen junger, pigmentierter Meerschweinchen. Die Vorteile dieses Protokolls bestehen darin, dass es qualitativ hochwertige RPE-Proben liefert, die relativ frei von Kontaminationen sind, wobei die RNA für RNA-spezifische Analysen geeignet konserviert ist und dennoch relativ einfach und effizient ist. Während in dem hier gezeigten Beispiel die RPE-Proben aus den Augen eines jungen (2 Wochen alten) Meerschweinchens entnommen wurden, wurde das Protokoll auch erfolgreich verwendet, um RPE-Proben von älteren (jungen erwachsenen) Tieren zu sammeln.
Für Forscher mit minimaler Vorerfahrung mit Augenoperationen oder Dissektionen können die Protokollschritte 2.1 und 2.2 eine Herausforderung darstellen. Das entscheidende Detail in Schritt 2.1 ist die Position des ersten Schnitts in der Sklera, der genau 1,0 mm hinter dem Limbus platziert werden sollte, damit Iris und Linse zusammen mit der Hornhaut entfernt werden, wenn das vordere Segment abgelöst wird. Wenn stattdessen die Iris am hinteren Augensegment befestigt bleibt, ist es schwierig, die Zonule von Zinn zu finden, die für eine erfolgreiche Ablösung der Netzhaut im nächsten Schritt entscheidend ist. Wie im Protokoll erwähnt, ist es für die erfolgreiche Ablösung der Netzhaut auch wichtig, dass die Netzhaut nicht direkt mit der Pinzette gegriffen wird, um eine Fragmentierung zu vermeiden. Die Netzhaut des Meerschweinchens scheint zerbrechlicher zu sein als die Netzhaut der Maus, wahrscheinlich aufgrund ihrer avaskulären Natur20. Idealerweise sollte die isolierte hintere Augenmuschel, bestehend aus RPE, Aderhaut und Sklera, innerhalb von 5 Minuten nach der Augenenukleation in ein Gewebespeicherreagenz getaucht werden, um die ausreichende Konservierung der RNA in der gesammelten RPE-Probe sicherzustellen.
Die SRIRS-Methode, die speziell für den Zweck entwickelt wurde, qualitativ hochwertige RPE-Proben aus den Augen von Mäusen zu sammeln, scheint dieses Ziel für Mausaugen erreicht zu haben. Es wird berichtet, dass es sowohl effizient als auch effektiv ist18. Diese Technik wurde auch erfolgreich eingesetzt, um RPE aus gesunden menschlichen Spenderaugen zu sammeln21. Basierend auf den Erfahrungen der Autoren ist diese SRIRS-Methode jedoch nicht geeignet, um RPE aus den Augen von Meerschweinchen, Baumspitzmaus und Opossum zu sammeln, obwohl die zugrunde liegenden Gründe dafür nicht klar sind. Durch die Berichterstattung über die hier beschriebene Technik zur Isolierung und Sammlung von RPE aus den Augen junger Meerschweinchen hoffen wir, einen wichtigen ungedeckten Bedarf im Bereich der Myopieforschung zu decken.
In Bezug auf die Einschränkungen des beschriebenen Protokolls ist die wichtigste die Notwendigkeit einer praktischen Schulung, um die effiziente Entnahme von Proben zu gewährleisten, da neben der Reinheit der gesammelten RPE-Proben auch die Zeit bis zur Fertigstellung entscheidend ist. Forscher, die keine Erfahrung mit okulärer Mikrodissektion oder Chirurgie haben, benötigen am dringendsten eine Ausbildung. Obwohl über mehrere RPE-Isolationsmethoden berichtet wurde22,23, ist die hier beschriebene Methode aufgrund der Verwendung eines RNA-stabilisierenden Reagenzes nicht für RPE-Zellkulturen oder Proteinanalysen geeignet.
Es ist seit langem bekannt, dass das RPE nicht nur bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit und Funktion der Netzhaut, sondern auch bei verwandten Krankheiten eine entscheidende Rolle spielt. Die Tatsache, dass das RPE nun auch eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Augenwachstums und der Entwicklung der Myopie spielt, hat den Umfang der Forschungsfragen erheblich erweitert, für die die Fähigkeit, qualitativ hochwertige RPE-Proben entweder aus den Augen von Meerschweinchen, wie hier beschrieben, oder von anderen Säugetieren, die als Tiermodelle verwendet werden, zu sammeln, der Schlüssel zu neuen Erkenntnissen sein kann. Solche Studien können auch neue Erkenntnisse über die pathologischen Komplikationen der Myopie liefern, einschließlich der myopischen Makulopathie, für die erwartet werden kann, dass die Prävalenzzahlen parallel zu den Myopie-Prävalenzzahlen an sich steigen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Studie wird von der Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (S.G.), einem Loris and David Rich Postdoctoral Scholar (S.G.) und einem Stipendium des National Eye Institute of the National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
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