Disección de tejido pancreático para aislar células individuales viables
Summary
Las células metaplásicas pancreáticas son precursoras de células malignas que dan lugar a tumores pancreáticos. Sin embargo, aislar células pancreáticas viables intactas es un desafío. Aquí, presentamos un método eficiente para la disociación del tejido pancreático. A continuación, las células pueden utilizarse para la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) o para el cocultivo bidimensional o tridimensional.
Abstract
El páncreas incluye dos sistemas principales: el sistema endocrino, que produce y secreta hormonas, y el sistema exocrino, que representa aproximadamente el 90% del páncreas e incluye células que producen y secretan enzimas digestivas. Las enzimas digestivas se producen en las células acinares pancreáticas, se almacenan en vesículas llamadas zimógenos y luego se liberan en el duodeno a través del conducto pancreático para iniciar los procesos metabólicos. Las enzimas producidas por las células acinares pueden matar células o degradar el ARN libre de células. Además, las células acinares son frágiles, y los protocolos de disociación comunes dan como resultado un gran número de células muertas y proteasas y RNasas libres de células. Por lo tanto, uno de los mayores desafíos en la digestión del tejido pancreático es recuperar las células intactas y viables, especialmente las células acinares. El protocolo presentado en este artículo muestra un método de dos pasos que desarrollamos para satisfacer esta necesidad. El protocolo se puede utilizar para digerir el páncreas normal, el páncreas que incluye lesiones premalignas o los tumores pancreáticos que incluyen un gran número de células estromales e inmunitarias.
Introduction
El adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) es uno delos tipos de cáncer más agresivos. La evidencia clínica apoya la idea de que el PDAC se desarrolla a partir de células del sistema exocrino, incluidas las células acinares, a lo largo de muchos años, impulsadas por mutaciones en el protooncogén KRAS2.
Los tumores de páncreas incluyen muchos tipos de células diferentes, y se ha demostrado que las células malignas representan solo el 20%-50% dela masa tumoral. Los diferentes tipos de células interactúan con las células epiteliales, apoyan su transformación y mejoran la formación y el crecimiento de tumores. Los eventos tempranos causan metaplasia acinar, que da lugar a lesiones microscópicas llamadas neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), que en algunos casos pueden convertirse en PDAC4.
Existe una necesidad crítica de investigar estas interacciones y apuntar a las señales fundamentales. La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) es un método potente que revela la expresión génica con una resolución de una sola célula, rastreando así los cambios que experimentan las células epiteliales, lo que permite explorar el desarrollo del cáncer de páncreas.
La disección de tejidos y la digestión de células individuales es la primera etapa de un experimento scRNA-seq. Varios factores hacen que la digestión del tejido pancreático sea especialmente difícil: i) las células acinares representan más del 90% del páncreas y las células acinares contienen grandes cantidades de enzimas digestivas, incluidas proteasas y RNasas que reducen la calidad de las bibliotecas basadas en ARN; ii) las células acinares son muy sensibles y pueden lisarse si se utilizan protocolos normalizados; (iii) las células acinares expresan un pequeño número de genes a niveles muy altos. Por lo tanto, si estas células se lisan durante el experimento, esto puede contaminar el perfil de expresión génica observado de otras células; (iv) El tejido pancreático recuperado de los tumores es desmoplásico, lo que dificulta su disección sin dañar las células. Por lo tanto, aunque se requiere mantener una alta viabilidad de todos los tipos de células, el gran número y la sensibilidad de las células acinares añaden complejidad adicional. Estos factores imponen dificultades para lograr una suspensión unicelular que sea viable en más del 80% y no tenga grumos, como se requiere para los experimentos de scRNA-seq.
En este caso, desarrollamos un protocolo con tripsina C y colagenasa P, junto con una monitorización frecuente de los tejidos. Esto apoya la disociación a células individuales al tiempo que conserva una alta viabilidad para respaldar el éxito de los experimentos de scRNA-seq 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, presentamos un protocolo para la disociación del tejido pancreático. El protocolo es simple, fácil de usar y proporciona una herramienta para aislar células individuales viables del tejido pancreático en diferentes etapas durante el proceso de malignidad, incluidos los tumores sólidos. En estudios previos, se utilizaron diferentes tipos de colagenasas para digerir el páncreas 8,9. El uso de una colagenasa muy potente, como la colagenasa …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la Dra. Avital Sarusi-Portuguez por su ayuda en el análisis de datos y al Dr. Dror Kolodkin-Gal por su ayuda en el establecimiento del protocolo en un estudio anterior. Agradecemos a todos los miembros pasados y presentes del laboratorio Parnas. Agradecemos a la Dra. Gillian Kay y al Dr. Michael Kanovsky por su ayuda en la edición. Este proyecto ha recibido financiación de la beca de la Fundación de Ciencias de Israel (No. 526/18 O.P.), el Programa Alex U. Soyka y una subvención del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel (Premio al Desarrollo de la Carrera de Investigación).
Materials
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
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