Количественная оценка репликационного стресса в клетках рака яичников с использованием одноцепочечной иммунофлуоресценции ДНК
Summary
Здесь мы описываем основанный на иммунофлуоресценции метод количественной оценки уровней одноцепочечной ДНК в клетках. Этот эффективный и воспроизводимый метод может быть использован для изучения стресса репликации, который является общей чертой при некоторых видах рака яичников. Кроме того, этот анализ совместим с автоматизированным конвейером анализа, что еще больше повышает его эффективность.
Abstract
Репликационный стресс является отличительной чертой нескольких видов рака яичников. Репликационный стресс может возникать из нескольких источников, включая двухцепочечные разрывы, конфликты транскрипции-репликации или амплифицированные онкогены, что неизбежно приводит к генерации одноцепочечной ДНК (ссДНК). Таким образом, количественная оценка ssDNA дает возможность оценить уровень репликационного стресса в различных типах клеток и при различных условиях или методах лечения, повреждающих ДНК. Новые данные также свидетельствуют о том, что ssDNA может быть предиктором ответов на химиотерапевтические препараты, которые нацелены на репарацию ДНК. Здесь мы подробно описываем основанную на иммунофлуоресценции методологию количественного определения ssDNA. Эта методология включает маркировку генома аналогом тимидина с последующим обнаружением аналога хроматина на основе антител в условиях без денатурации. Участки ssDNA можно визуализировать в виде очагов под флуоресцентным микроскопом. Количество и интенсивность очагов напрямую коррелируют с уровнем ссДНК, присутствующей в ядре. Мы также описываем автоматизированный конвейер для количественной оценки сигнала ssDNA. Метод быстрый и воспроизводимый. Кроме того, простота этой методологии делает ее пригодной для высокопроизводительных приложений, таких как скрининг лекарств и генетический скрининг.
Introduction
Геномная ДНК часто подвергается множественным атакам из различных эндогенных и экзогенных источников1. Частота эндогенных повреждений напрямую коррелирует с уровнями побочных продуктов метаболизма, таких как активные формы кислорода или альдегиды, которые по своей природе выше при нескольких типах рака, включая рак яичников 2,3. Крайне важно, чтобы повреждение ДНК было эффективно устранено; в противном случае он может способствовать генотоксическим поражениям и, следовательно, мутагенезу. Способность клеток восстанавливать генотоксические поражения зависит от функциональности безошибочных путей репарации ДНК и эффективной регуляции прогрессирования клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК. Примечательно, что многие виды рака яичников имеют функционально инактивирующие мутации в р53 и, таким образом, имеют дефектную контрольную точку G1 / S, что приводит к тому, что клетки инициируют репликацию ДНК, несмотря на наличие невосстановленных геномных поражений 4,5. Степень повреждения ДНК при раке яичников еще больше усугубляется наблюдением, что более 50% серозной карциномы яичников высокой степени злокачественности (HGSOC) имеют дефекты в гомологичной рекомбинации, опосредованной BRCA1 и BRCA2, безошибочном пути репарации ДНК, и около 20% имеют амплификацию в гене CCNE1, который преждевременно выталкивает клетки G1 в S-фазу6 . Вместе высокая частота эндогенных повреждений ДНК, дефектные контрольные точки и неисправные пути восстановления экспоненциально усиливают накопление геномных поражений при раке яичников. Эти поражения могут служить препятствием для прогрессирования критических клеточных процессов, таких как репликация ДНК и транскрипция. Как обсуждается ниже, такие препятствия катализируют генерацию одноцепочечной ДНК (ssDNA) в клетках.
Двойная спираль ДНК имеет решающее значение для защиты генома от множественных мутагенных процессов, таких как спонтанная депуринация и депиримидинация, активность цитозиндезаминаз и окислительное повреждение ДНК 1,7. Напротив, ssDNA очень уязвима к этим мутационным событиям. Множественные процессы в клетках могут привести к генерации ssDNA (рис. 1). К ним относятся следующие:
(i) Остановка механизма репликации ДНК: это приводит к разъединению геликазы ДНК и полимеразы, оставляя участки ssDNA 8,9.
(ii) Остановка транскрипционного механизма: стойкая остановка РНК-полимеразы приводит к образованию трехцепочечных гибридных структур ДНК/РНК, называемых R-петлями. Образование R-петли обнажает смещенную, нетранскрибируемую ДНК в виде одной цепи10.
(iii) Резекция конца ДНК: Инициация репарации, направленной на гомологию, требует генерации 3′-ссДНК для катализа поиска гомологичной последовательности11.
(iv) D-петля: инвазия цепи во время гомологичной рекомбинации может привести к смещению нематричной комплементарной цепи, что приводит к ssDNA12.
(v) Разрывы, связанные с репликацией: Во время репликации ДНК синтез запаздывающей цепи происходит прерывистым образом, в результате чего фрагменты Окадзаки сначала генерируются, а затем лигируются. Задержка или дефект в обработке фрагментов Окадзаки также может привести к образованию ssDNA. Наконец, если репликационная вилка на ведущей цепи сталкивается с остановившимся повреждением, ДНК-полимеразой и праймазой, PRIMPOL может перепрограммировать синтез ниже по течению, оставляя разрыв ssDNA позади13,14.
Очевидно, что большинство из этих событий происходит либо тогда, когда механизм репликации ДНК сталкивается с геномными повреждениями, либо во время репарации, связанной с репликацией, что позволяет предположить, что более высокое повреждение ДНК приводит к повышению уровня ссДНК. Поскольку многие из этих событий связаны с репликацией, образование ssDNA считается маркером «репликационного стресса» в клетках15,16.
Здесь мы описываем анализ, который может быть использован для надежного количественного определения ssDNA в клетках. Простота, воспроизводимость и экономическая выгода этого подхода позволяют использовать его для оценки реакции репликации-стресса в клетках. Новые исследования показали, что уровень ssDNA также может быть предиктором ответов на химиотерапию, таких как ингибиторы ферментов PARP1/2, ATR и киназы Wee1 17,18,19,20,21. Эти ингибиторы используются в схеме лечения нескольких HGSOCs22. Таким образом, этот анализ также может быть полезным инструментом для прогнозирования химиотерапевтических реакций в клетках рака яичников.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как было упомянуто в протоколе, полезно включить несколько экспериментальных контролей, чтобы убедиться, что анализ работает. К ним относятся образец, не обработанный IdU, а также образец, обработанный первичными антителами. Оба отрицательных элемента управления должны давать клетки, о?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PV поддерживается грантом Inaugural Pedal the Cause от Онкологического центра Элвина Дж. NR поддерживается грантом NIH Cell and Molecular Biology Training T32 для Вашингтонского университета в Сент-Луисе.
Materials
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D’Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -. M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA’s first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
