Glioblastoma için İmmünoterapi Stratejisi Olarak Fungal β-Glukan'ın İzolasyonu ve Saflaştırılması
Summary
Bu protokol, dört farklı mantar β-glukanının saflaştırma adımlarını ve sonraki çalışmalarını, glioblastoma hücrelerine karşı mikroglia’nın anti-tümöral özelliklerini geliştiren potansiyel immünomodülatör moleküller olarak tanımlamaktadır.
Abstract
Glioblastoma karşı etkili tedaviler geliştirmedeki en büyük zorluklardan biri, tümör mikro ortamındaki güçlü bağışıklık baskılanmasının üstesinden gelmektir. İmmünoterapi, bağışıklık sistemi tepkisini tümör hücrelerine karşı çevirmek için etkili bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Glioma ile ilişkili makrofajlar ve mikroglia (GAM’lar) bu tür anti-enflamatuar senaryoların ana itici güçleridir. Bu nedenle, GAM’larda anti-kanseröz yanıtın arttırılması, glioblastoma hastalarını tedavi etmek için potansiyel bir ko-adjuvan tedaviyi temsil edebilir. Bu damarda, mantar β-glukan molekülleri uzun zamandır güçlü bağışıklık modülatörleri olarak bilinmektedir. Doğuştan gelen bağışıklık aktivitesini uyarma ve tedavi yanıtını iyileştirme yetenekleri tanımlanmıştır. Bu modüle edici özellikler kısmen, ilginç bir şekilde, GAM’larda büyük ölçüde ifade edilen örüntü tanıma reseptörlerine bağlanma yeteneklerine atfedilir. Bu nedenle, bu çalışma, glioblastoma hücrelerine karşı mikroglia’nın tümör öldürücü tepkisini arttırmak için mantar β-glukanların izolasyonu, saflaştırılması ve daha sonra kullanılmasına odaklanmıştır. Fare glioblastomu (GL261) ve mikroglia (BV-2) hücre hatları, mevcut biyofarmasötik endüstrisinde yoğun olarak kullanılan mantarlardan ekstrakte edilen dört farklı mantar β-glukanının immünomodülatör özelliklerini test etmek için kullanılır: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ve Ganoderma lucidum. Bu bileşikleri test etmek için, önceden aktive edilmiş mikroglia şartlandırılmış bir ortamın glioblastoma hücrelerinde proliferasyon ve apoptoz aktivasyonu üzerindeki etkisini ölçmek için ko-stimülasyon testleri yapıldı.
Introduction
Nöro-onkoloji alanında yeni başarıların ortaya çıkmasına rağmen, glioblastoma hastalarının yaşam beklentisi yetersiz kalmaktadır. Beyin tümörlerine karşı altın standart tedaviler cerrahi, radyoterapi ve kemoterapinin birleştirilmesine dayanır. Bununla birlikte, son on yılda, immünoterapi, farklı kanser türlerini tedavi etmek için güçlü bir strateji olarak ortaya çıkmıştır1. Bu nedenle, vücudun tümör hücrelerine karşı bağışıklık tepkisini kullanma olasılığı son zamanlarda onkolojinin dördüncü ayağı haline gelmiştir.
Alandaki en büyük zorluklardan birinin, tümör mikroçevre2’de bulunan güçlü immünsüpresyonun üstesinden gelmek olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Özellikle, beyin kanserinin en yaygın ve agresif formlarından biri olan glioblastoma durumunda, bu tür pro-tümöral senaryoları düzenleyen kilit yolları çözmek ve bağışıklık sisteminin iç karartıcı tepkisine karşı koyabilecek yeni bileşikler bulmak, bu tedavi edilemez hastalığa karşı gelecekteki tedavilerin yolunu açabilir.
Beyin kendi bağışıklık sistemi hücrelerine sahiptir ve en alakalı hücre tipi mikrogliadır. Bu hücrelerin farklı merkezi hastalıklarda oldukça karmaşık bir davranışa sahip oldukları kanıtlanmıştır3. Primer beyin tümörleri (örneğin, glioblastoma) durumunda, bu hücreler beyin parankimini kolonize etmek için tümör hücrelerini destekleyen bir anti-enflamatuar fenotipe doğru kaydırılır3. Çok sayıda yayın, tümör progresyonu sırasında bu hücrelerin ana rolünü arttırmıştır. Bunun başlıca nedenlerinden biri, glioma ile ilişkili mikroglia ve infiltrasyon makrofajlarının (GAM’lar) toplam tümör kütlesinin üçte birini oluşturmasıdır, bu nedenle beyin tümörü ilerlemesi sırasında aktivasyon durumlarının kesin etkisini düşündürmektedir 4,5.
Bu bağlamda, mantar β-glukanlar, fagositoz ve pro-inflamatuar faktörlerin üretimi de dahil olmak üzere etkili immün yanıtları tetikleyen ve zararlı ajanların eliminasyonuna yol açan güçlü moleküller olarak tanımlanmıştır 6,7,8,9,10. Mantar β-glukanlar genellikle farklı mantar parçalarından elde edilen ekstraktlar kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, spesifik etkilerin atfedilmesi, belirsizliklerden kaçınmak ve immünomodülatör ajanlar gibi moleküllerin etki mekanizmasını anlayabilmek için saflaştırılmasını gerektirir8.
Bu çalışmada, çözünür β-glukanlar, düzenli olarak yenilebilir (Pleurotus ostreatus ve Pleurotus djamor) ve tıbbi (Ganoderma lucidum ve Hericium erinaceus) mantarlar olarak kullanılan dört farklı mantarın meyve veren gövdesinden saflaştırılır. Özellikle, bu dört mantar gıda ve ilaç endüstrisinde büyük kullanıma sahiptir ve ticari bir işletmede çevre dostu bir döngüsel ekonomi içinde üretilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
Beyin kanseri tedavilerinde mantar β-glukanların gelecekteki kullanımının temelini atmak için, iyi tanımlanmış saflaştırma stratejileri ve bağışıklık sistemi hücreleri ile varsayılan etkileşimlerini araştıran klinik öncesi çalışmalar, anti-tümör aracıları olarak potansiyel rollerini değerlendirmek için gereklidir. Bu çalışma, seçilen mantarın meyve veren gövdelerinde bulunan çözünür β-glukanları elde etmek için gereken sayısız izolasyon ve saflaştırma adımını açıklamaktadır. Başarılı bir şekilde saflaştırıldıktan sonra, mikroglia hücreleri enflamatuar fenotiplerini arttırmak için aktive edilir. Fare glioblastoma hücreleri (GL261), daha önce bu ekstraktlarla muamele edilen farklı bir mikroglia şartlandırılmış ortam ile kaplanır ve daha sonra tümör hücrelerinin davranışları üzerindeki etkisi değerlendirilir. İlginç bir şekilde, laboratuvarımızdan yapılan pilot çalışmalar (veriler gösterilmemiştir), pro-inflamatuar mikroglia’nın sadece glioblastoma hücrelerinde değil, diğer kanser hücre hatlarında da tümör hücresi göçünü ve istila özelliklerini nasıl yavaşlatabileceğini ortaya çıkarmıştır. Bu multidisipliner çalışma, onkoloji araştırmacılarının birçok farklı tümör türünde bağışıklık tepkisini artırabilen umut verici bileşikleri test etmeleri için yararlı bir araç sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, SβG’lerin içeriğini dört farklı mantardan başarılı bir şekilde izole etmek, saflaştırmak ve karakterize etmek için köklü tekniklerin kullanımını açıklamaktadır. Sonuçlar, P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus’tan elde edilen SMP’lerin sıcak su ekstraksiyonundan ve ardından α-amilaz, glukozidaz ve proteaz ile hidrolitik işlemden sonra, α-glukan ve protein içeriğinin nasıl azaldığını ve böylece saf SβG’lerin miktarını önemli ölç…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Vasiliki Economopoulos’a ImageJ’deki fuluorescence sinyalini ölçmek için hazırladığı kurum içi senaryosu için teşekkür ederiz. Ayrıca CITIUS’a (Sevilla Üniversitesi) ve tüm personeline gösteri sırasındaki destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma İspanyol FEDER I + D + i-USE, Sevilla Üniversitesi’nden US-1264152 ve Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00 tarafından desteklenmiştir
Materials
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M. Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Recherche en cancérologie. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
