본 논문은 생체 내에서 고해상도로 상처 치유를 위해 살아있는 Clytia hemisphaerica medusa의 상피에 상처를 만드는 방법을 설명 한다. 또한, 상처 치유 동안 상피 세포 및 세포 외 기질의 신호 전달 과정을 교란시키기 위해 염료 및 약물을 도입하는 기술이 제시됩니다.
피부에서 눈, 내장에 이르기까지 모든 동물의 장기는 상피 세포 시트로 덮여있어 항상성을 유지하면서 감염으로부터 보호 할 수 있습니다. 따라서 상피 상처를 복구하는 능력이 모든 후생 동물에게 중요하다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 척추동물의 상피 상처 치유는 염증 반응, 혈관 형성 및 재상피화를 포함한 중첩 과정을 포함합니다. 이러한 과정의 조절은 상피 세포, 이웃 세포 및 세포외 기질(ECM) 사이의 복잡한 상호작용을 포함합니다. ECM에는 구조 단백질, 조절 단백질 및 활성 소분자가 포함되어 있습니다. 이러한 복잡성은 대부분의 동물이 불투명한 조직과 접근하기 어려운 ECM을 가지고 있다는 사실과 함께 살아있는 동물에서 상처 치유를 연구하기 어렵게 만듭니다. 따라서 상피 상처 치유에 대한 많은 연구가 조직 배양 시스템에서 수행되며, 단일 상피 세포 유형은 인공 매트릭스에 단층으로 도금됩니다. Clytia hemisphaerica (Clytia)는 이러한 연구에 독특하고 흥미로운 보완 기능을 제공하여 진정한 ECM을 가진 온전한 동물에서 상피 상처 치유를 연구할 수 있도록 합니다. Clytia의 외배엽 상피는 큰 편평 상피 세포의 단일 층으로, 살아있는 동물에서 DIC(Differential Interfering Contrast) 현미경을 사용하여 고해상도 이미징을 가능하게 합니다. 이동 섬유아세포, 혈관구조 또는 염증 반응이 없기 때문에 생체 내 재상피화에서 중요한 사건을 해부할 수 있습니다. 단세포 미세상처, 크고 작은 상피 상처, 기저막을 손상시키는 상처 등 다양한 유형의 상처의 치유를 분석할 수 있습니다. 라멜리포디아 형성, 지갑 끈 수축, 세포 스트레칭 및 집단 세포 이동이 모두 이 시스템에서 관찰될 수 있습니다. 또한 ECM을 통해 약리학적 제제를 도입하여 생체 내에서 세포:ECM 상호 작용 및 세포 과정을 수정할 수 있습니다. 이 작업은 살아있는 Clytia에서 상처를 만들고, 치유 영화를 캡처하고, ECM에 시약을 미세 주입하여 치유 메커니즘을 조사하는 방법을 보여줍니다.
상피 세포 시트는 모든 후생 동물의 외부 표면을 덮고 내부 장기를 정렬하며 동물의 몸을 별개의 구획으로 나눕니다. 상피는 또한 내부 신체를 외부 환경과 분리하고 손상과 감염으로부터 보호합니다. 따라서 상피층의 출현은 다세포 동물의 진화에 필수적인 부분이었으며, 상피층은 척추동물에서 가장 기초적인 후생동물에 이르기까지 모든 동물에서 볼 수 있다1. 일부 장기의 상피는 폐 공기 주머니, 혈관, 장2과 같은 단일 단층이며, 플라나리아와 자포동물과 같은 무척추동물의 표피에서도 존재한다3. 척추동물의 피부(skin)4와 각막(cornea)5과 같은 다른 조직에서는 상피가 층화되어 있는데, 이는 여러 개의 상피세포층(epithelial cell layer)2이 존재한다는 것을 의미한다. 모든 경우에, 가장 기저 상피층은 세포외 기질 (ECM)의 특수 영역을 형성하는 단백질 시트 인 기저막에 부착됩니다.6,7,8.
연속적인 상피 시트를 재현하기 위해 상피의 균열을 신속하게 복구해야 합니다. 상피 손상은 장에서 상피 세포가 흘러 나오는 것과 같은 자연적 과정에서 발생하며,9,10 염증이나 신체적 외상의 결과로 발생합니다. 단일 상피 세포가 손상되면, 주변 세포가 서로 부착되어 구멍(11, 12)을 닫을 수 있도록 스스로 복구하거나 제거해야 한다. 단일 세포의 크기보다 큰 상처에서, 상피 세포는 서로 도달하고 시트13을 복구하기 위해 이동해야 한다. 이것은 갭이 작거나 상처 갭을 닫기 위해 상처의 가장자리에서 상피 세포의 이동을 필요로 할 수 있는 경우 세포 확산에 의해 달성될 수 있습니다. 이 후자의 과정을 재상피화(re-epithelialization)라고 한다14,15. 배아 조직에서, 상피 세포는 상처를 닫기 위해 퍼지고 이동하거나, 지갑 끈과 유사한 메커니즘으로 상처 가장자리에서 세포 사이에 형성되는 악토미오신 케이블의 수축에 의해 틈을 가로질러 당겨집니다(16). 많은 성인 조직에서, 재상피화는 세포가 이웃 세포와의 접합을 유지하는 간섭성 세포 시트의 이동을 수반한다14,17,18. 다른 조직에서는 세포:세포 연결이 해체되고 상피 세포는 중간엽 세포처럼 행동하여 재상피화 동안 조정되지만 독립적인 방식으로 상처 부위로 이동합니다 14,19,20,21.
상피 세포 이동은 이동하는 세포 사이, 세포와 ECM 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조절됩니다. 상피 세포의 상처 활성화 및 후속 이동 메커니즘을 다루는 엄청난 양의 실험 문헌이 있지만 아직 밝혀야 할 것이 많이 남아 있습니다. 예를 들어, 상처에 반응하여 상피 세포를 활성화시켜 이동하는 초기 신호는 확실하게 확인되지 않았으며(22), 상처에 가장 가까운 상피 세포 측면에 라멜리포디아를 생성하기 위해 액틴이 어떻게 재배치되는지도 완전히 이해되지 않았다 22,23,24,25,26,27. 집단 세포 이동은 상처 원위 세포와 공유하기 위해 상처 세포의 정보를 필요로 하며, 의사소통 경로는 여전히 불분명하다28. 셀:셀 접합부와 셀:ECM 부착물은 시트 내의 셀이 스스로 재배열됨에 따라 분해 및 개질되어야 하지만, 이 과정의 조절은 잘 이해되지 않고 있다14,29. 이러한 질문과 기타 관련 질문에 대한 진전은 근본적인 생물학적 문제로서 중요할 뿐만 아니라 올바른 상처 치유의 임상적 중요성 때문에 중요합니다. 상피 세포가 올바르게 이동하는 능력을 손상시키는 질병은 만성 상처를 초래합니다. 예를 들어 유전 질환인 수포성 표피박리증이 있는데, 여기서 ECM에 상피 세포가 부착되는 데 관여하는 유전자가 돌연변이되어 피부가 벗겨지고 물집이 생기는 연약한 피부가 됩니다. 재상피화는 또한 자연적으로 노화된 조직에서 손상된다30,31. 따라서 상처 치유 결과를 개선하기 위한 중재를 개발하려면 더 나은 이해가 필수적입니다.
상처 치유에서 상피 세포 이동은 시험관 내 접근법과 모델 유기체를 모두 사용하여 연구되었습니다. 상처 치유 및 세포 이동 메커니즘에 대한 대부분의 연구는 단일 상피 세포 유형의 단층이 ECM을 대체하는 기질에서 성장되는 조직 배양에서 수행되었습니다. 세포 단층은 특정 모양과 크기의 틈을 만들기 위해 스텐실로 긁히거나 성장한 다음 관찰됩니다32,33,34. 시험관 내 모델은 세포 행동의 이상적인 시각화뿐만 아니라 기질의 품질을 변화시키고, 세포를 약물과 비생물적 및 생물학적 요인에 노출시키고, 다양한 관심 유전자를 발현하거나 억제하는 구조로 세포를 형질감염시킬 수 있는 기회를 제공합니다. 그러나, 이러한 환원주의적 접근법은 ECM11에서 발생하는 다양한 세포 유형 및 신호 전달 이벤트 간의 통신을 포함하여 생체 내 맥락에서 상피 세포 거동과 관련된 중요한 매개변수 중 일부를 포착하지 못할 수 있습니다. 생체 내 모델은 여러 세포 유형, 겹치는 신호 전달 경로 및 복잡한 ECM35와 함께 상처의 진정한 맥락을 제공합니다. 상처 치유 연구를 위한 그러한 모델 중 하나는 마우스(19)이며, 최근의 발전으로 연구자들은 살아있는 동물(36)에서 전층 상처를 치유하는 동안 표피 세포를 관찰할 수 있게 되었다. 그러나 마우스 및 기타 생체 내 시스템은 재상피화를 연구하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 첫째, 자연적 맥락에서 세포 거동을 관찰하는 것의 가장 큰 이점은 혈액 응고, 면역 세포 및 염증의 모집, 섬유아세포의 모집, 세포 역분화, 재혈관화 및 ECM의 리모델링을 포함하여 척추동물 상처 치유 동안 발생하는 시간적으로 겹치는 사건의 복잡성과 균형을 이룹니다. 또한 불투명한 조직은 이미징을 어렵게 만듭니다. 초파리 유충과 제브라피쉬 표피 시스템(Zebrafish epidermamis system)37,38은 상대적으로 단순하기 때문에 이러한 어려움 중 일부를 극복했다(39).
우리 연구실은 최근 상피 상처 치유를 연구하기위한 새로운 모델을 도입했습니다 : hydrozoan cnidarian Clytia hemisphaerica (Clytia) 40의 메두사 (해파리) 형태. Clytia는 완전히 시퀀싱되고 주석이 달린 게놈41, 단일 세포 RNAseq 전사체 42 및 게놈 변형(돌연변이 유발 및 형질전환 발생)43,44,45을 위한 프로토콜을 갖춘 신흥 모델 유기체입니다. Cnidarians는 상피층을 가진 현존하는 가장 오래된 혈통 중 하나이므로 자포 상처 치유를 이해하면 상피 무결성을 보장하는 조상 경로에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 생명 나무 전체에 걸쳐 보존된 경로를 위해 Clytia는 상피 세포 역학과 생체 내 상처 치유의 기능적 조절을 연구하는 흥미롭고 새로운 시스템을 제공합니다.
Clytia medusa(exumbrella)의 윗면을 덮고 있는 상피는 너비가 약 50μm, 두께가 1-2μm인 투명한 편평 상피 세포의 단층입니다(그림 1). 그들은 해파리의 “젤리”인 mesoglea라고 불리는 ECM에 붙어 있습니다. 메조글레아는 척추동물을 포함한 다른 동물(46,47,48)에서 발견되는 ECM과 조성적으로 유사하고, 기저 막(40)을 가지며, 완전히 투명하다. Clytia medusa의 상피층은 쉽게 긁히거나 상처를 입을 수 있습니다 (아래 참조). 상피와 ECM의 단순성과 투명성은 치유 중 세포와 세포의 움직임에 대한 고해상도 이미징을 가능하게 합니다. 최근에, Kamran et al. Clytia 상피의 작은 상처 치유를 자세히 설명했습니다40. Clytia의 치유는 lamellipodia 기반 세포 크롤링, 세포 확산 및 집단 세포 이동뿐만 아니라 배아 시스템에서 더 전형적인 지갑 끈 폐쇄를 통해 발생한다는 것이 입증되었습니다(이전에는 각막과 같은 성인 동물 구조에서 볼 수 있었지만49). Clytia 상처 치유는 염증 반응40,50이없는 다른 시스템에서 볼 수 있듯이 매우 빠릅니다. Clytia exumbrella의 치유는 기존 상피 세포의 움직임에 전적으로 의존하며, 세포가 증식하거나 ECM을 통해 상처 부위로 이동하지 않습니다(보충 동영상 1). 이러한 모든 발견은 Clytia가 상피 상처 치유를 연구하는 데 유용한 모델 시스템임을 시사합니다. 실제로, 상처 치유 동안 Clytia의 상피 세포를 쉽게 이미징할 수 있었기 때문에 상피 세포 라멜리포디아가 손상되지 않은 기저막이 있는 한 노출된 ECM 영역에 걸쳐 확장되고 퍼진다는 발견이 이루어졌습니다. 기저막이 손상되면, 상피 치유는 지갑 끈 기구(40)로 전환된다. 이것은 lamellipodia 기반 크롤링 대 지갑 끈 폐쇄로 폐쇄하기로 한 결정의 기본 메커니즘에 대한 첫 번째 시연으로, 치유에서 특정 세포:ECM 상호 작용의 중요성과 자연적인 맥락에서 세포를 관찰하는 것의 중요성을 강조했습니다.
아래에서는 단일 세포 미세 상처, 주로 세포 확산에 의해 닫히는 작은 상처 및 닫히기 위해 집단 세포 이동이 필요한 큰 상처를 만들고 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한, ECM 및 상피 세포에 소분자를 도입하여 상처 치유의 추정 조절 경로의 실험적 섭동을 허용하는 프로토콜이 설명되어 있습니다.
여기서, 방법론은 비교적 새로운 무척추 동물 모델 유기체 인 Clytia에서 생체 내 상처를 이미징하기 위해 제시됩니다40,43,58. 이 시스템을 상처 치유 및 재상피화를 연구하는 데 사용되는 다른 모델과 구별되는 독특하고 강력한 연구 도구로 만드는 몇 가지 요인이 있습니다. 첫째, 단층 상피는 투명한 ECM에 부착되어 시험관 내 조직 배양 분석과 유사합니다(그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4). in vitro 분석에서와 같이 세포를 고해상도로 이미지화할 수 있습니다. 그러나 조직 배양과 달리 진정한 세포 환경과 ECM이 있어 상처 치유는 살아있는 부상당한 동물에서 발생하는 복잡한 신호 전달 사건의 맥락에서 볼 수 있습니다. 둘째, Clytia는 염증 반응, 이동 섬유아세포, 혈관 구조 및 혈액이 부족합니다. 이것은 상처 치유 동안 더 복잡한 성인 동물에서 발생하는 중복되는 사건이 없는 상태에서 생체 내에서 재상피화 과정을 연구할 수 있게 한다59. 셋째, ECM은 무세포(Supplemental Movie 1)이고 크기가 커서 미세 주사 바늘로 쉽게 접근할 수 있습니다(그림 5 및 그림 6). 이 접근법을 사용하여 연구자들은 생체 내 상처 치유에 대한 ECM 구조 또는 신호 전달을 교란시키는 약리학 적 시약의 효과를 테스트 할 수 있습니다. 시약은 또한 상피 세포에 도입될 수 있고, 생체내 상처 치유에 대한 이들의 효과를 평가할 수 있다. 넷째, Clytia 시스템42,43,44,45에서 돌연변이 및 형질 전환 동물을 생성하기위한 프로토콜이 존재합니다. 따라서 관심 유전자의 발현이 증가/감소한 동물에서 생체 내 상처 치유를 관찰할 수 있습니다.
이 기술에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 도 3에 나타난 바와 같이, 표준 광학 현미경으로는 거의 보이지 않는 평평하고 투명한 상피 세포로서 DIC 현미경에 맞게 올바르게 구성된 현미경을 사용할 필요가 있다. ECM을 훼손하지 않고 상피가 손상되도록 동물을 부드럽게 상처를 입히는 기술을 개발하는 것도 중요합니다. ECM에 물질을 미세 주입하는 경우에도 유사하게 부드러운 터치가 필요한데, 주사 중 동물에 대한 광범위한 손상이 상처 치유에 대한 후속 분석을 손상시킬 수 있기 때문입니다. 이러한 기술에 대한 학습 곡선이 있지만 초보자도 Malamy 연구실에서 빠르게 마스터했습니다. 실제로 이러한 프로토콜은 시카고 대학의 학부 실험실 과정에서 세포 이동을 입증하는 데 사용되었습니다.
최적의 이미징을 위해서는 동물이 움직이지 않고 선택한 상처 부위가 시야에서 벗어나지 않는 것이 중요합니다. 동물이 맥박을 뛰는 경우, 설명 된대로 Tricaine으로 치료하는 것이 매우 효과적입니다. 드리프트의 경우 샘플을 수동으로 재배치해야 하는 경우가 많습니다. 이러한 움직임은 FIJI/ImageJ의 등록 기능을 사용하여 최종 동영상에서 제거할 수 있습니다.
이 시스템의 한계는 여기에 설명된 방법을 사용하여 상처의 모양과 크기가 모두 다르기 때문에 동일한 상처를 만들 수 없다는 것입니다. 따라서 상처 봉합 또는 세포 이동의 정확한 속도를 정량화하는 것은 어려울 수 있습니다. 탄소 입자와 같은 위치 마커는 상처 입은 동물에서 노출된 ECM에 달라붙고, 큰 상처에서 집단 세포 이동 속도를 측정하기 위해 사용될 수 있다 (도시되지 않음). 작은 상처 봉합 분석의 경우 상처 크기와 모양이 가변적이더라도 이 크기의 상처 중 봉합 속도 범위가 제한적입니다(그림 4). 따라서 촉진 또는 억제 약리학 적 시약의 효과를 정량적으로 검출 할 수 있습니다.
이 연구는 DIC 현미경만을 사용하여 상처 치유의 특성을 설명하지만, 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 치유를 이미지화하는 데에도 동일한 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 이를 돕기 위해 다양한 세포 및 세포외 단백질이 형광 표지된 형질전환 동물을 생성하기 위한 프로토콜이 마련되어 있습니다. 약리학적 제제 또는 돌연변이 계통을 사용한 상처 치유의 교란과 결합된 DIC 및 형광을 사용한 동시 이미징은 상피의 상처 치유 과정의 기초가 되는 메커니즘을 이해하는 강력한 접근 방식이 될 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
E.E.L.L. 국립 과학 재단 PRFB 2011010의 보조금으로 지원됩니다. 클리티아 식민지 건설에 도움을 준 Tsuyoshi Momose와 Evelyn Houliston, 미세 상처 치유 이미지 수집에 도움을 준 Jean-Baptiste Reynier, 유사 크라이젤 탱크 건설에 대해 Harry Kyriazes, Clytia 서식지를 유지해 준 Elizabeth Baldo에게 감사드립니다. 그림 1B는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source | Kramer Scientific Corporation | ||
AxioCam 506 mono | ZEISS | 426557-0000-000-MA285 | |
Capillary tubes | World Precision Instruments | TW1004 | |
Cytochalasin B | Abcam | ab143482 | |
Depression slides | Amscope | BS-C12 | |
DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp | Leica | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
Fast Green FCF | Thermo Scientific | A16520-06 | |
FM1-43 | Biotium | 70022 | Excitation/Emission: 480/598 nm |
Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | Excitation/Emission: 361/497 nm |
imageJ | NIH | ||
Microloader tips (0.5-10 μL /2-20 μL) | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | 3301R / M3301L | |
Microscope Cover Glass (22X40-1.5) | Fisherbrand | 12-544-BP | |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB085713A | |
PicoNozzle v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
Pipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
Polycarbonate vacuum, desiccator | Bel-art | F42025-0000 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
STEMI Sv11 Dissection scope | ZEISS | STEMI SV11 | |
SYLGARD 184 | Dow Silicones | 1024001 | |
Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
Z-Hab mini system | Pentair | ||
ZEN Microscopy software | Zeiss |