Стандартизация цитометрического анализа на основе антител к яичному желтку
Summary
В данном протоколе описана методика подготовки латексных шариков для анализов с использованием антител IgY для выявления антигена.
Abstract
Иммунологические анализы являются важными тестами для обнаружения многочисленных молекулярных мишеней. Среди методов, доступных в настоящее время, цитометрический анализ шариков приобрел известность в последние десятилетия. Каждая микросфера, считываемая оборудованием, представляет собой событие анализа способности к взаимодействию между испытуемыми молекулами. Тысячи этих событий считываются в одном анализе, что обеспечивает высокую точность и воспроизводимость анализа. Эта методология также может быть использована для валидации новых входных данных, таких как антитела IgY, для диагностики заболеваний. Эти антитела получают путем иммунизации цыплят интересующим антигеном и последующего извлечения иммуноглобулина из желтка яиц животных; Таким образом, это безболезненный и высокопродуктивный метод получения антител. В дополнение к методологии высокоточной валидации способности к распознаванию антител в этом анализе, в данной работе также представлен метод извлечения этих антител, определения наилучших условий сопряжения антител и латексных шариков, а также определения чувствительности теста.
Introduction
Среди методов иммунологического анализа, направленных на диагностику заболеваний, цитометрический анализ шариков стал высокочувствительным и надежным подходом, поскольку он позволяет анализировать тысячи частиц в одном анализе1. Этот метод, помимо высокой производительности и возможности использования меньших объемов образцов, также обладает большой гибкостью, поскольку позволяет обнаруживать несколько молекул, таких как цитокины, молекулы адгезии, изотипы антител и белки 2,3.
Для разработки этих анализов используются различные частицы, в том числе латексные шарики, которые являются эффективным и недорогим сырьем. Они могут представлять модификации на своей поверхности, такие как наличие функциональных групп или белков, которые допускают ковалентное или нековалентное соединение определенных молекул 3,4,5.
Эти иммунологические анализы используют такие компоненты, как антигены и антитела, для обнаружения маркеров заболеваний и обычно требуют антител от млекопитающих, таких как мыши, кролики и козы. Это создает проблемы, связанные с этическими вопросами, поскольку иммунизация млекопитающих, как правило, требует большого количества животных для получения хорошего урожая, а также частого выполнения процедур, которые приводят к страданиям животных 6,7. Альтернативой этому является использование антител IgY, выделенных из яичных желтков иммунизированных цыплят, поскольку в желтках могут быть обнаружены высокие концентрации специфических антител против инокулированных антигенов; Производство курицы эквивалентно производству 4,3 кроликов в течение года 6,7.
Таким образом, целью данного протокола является предоставление метода оценки антител IgY, полученных из желтков куриных яиц, с помощью проточной цитометрии с латексными шариками. Для этого мы предлагаем метод стандартизации цитометрического шарикового иммуноферментного анализа в формате сэндвича с использованием латексных шариков. В качестве модели использовали антитела IgY, направленные на антиген Plasmodium falciparum , богатый гистидином белка II (IgY-PfHRP2). Мы описываем метод экстракции антител, обсуждаем критические этапы определения их связывающей концентрации с латексными шариками и представляем оценку предела обнаружения антигена. Высокая точность проточной цитометрии в сочетании с низкой стоимостью латексных шариков делают этот метод применимым для анализа иммуноферментных инструментов, таких как антитела и антигены. Этот метод может быть использован для обнаружения разноплановых целей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод осаждения антител IgY путем снижения рН с последующим разделением липидов с помощью каприловой кислоты эффективен для выделения общих антител без потери функциональности. Предложенный здесь метод проще и дешевле, чем тот, о котором сообщили Redwan et al.11, в которых также и…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить FIOCRUZ (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), Программу последипломного образования в области биотехнологии (PPGBIOTEC at the Universidade Federal do Amazonas – UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) и Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) за предоставление стипендий. Рисунки 2 и 4 были созданы с помощью biorender.com.
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
References
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
