JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Neutrofil livslängdsförlängning med CLON-G och en in vitro spontan dödsanalys

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65132
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People’s Hospital,University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem,Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children’s Hospital,Dana-Farber /Harvard Cancer Center

Summary

Detta protokoll beskriver beredningen av CLON-G för att förlänga neutrofillivslängden till mer än 5 dagar och ger en tillförlitlig procedur för utvärdering av neutrofildöd med flödescytometri och konfokal fluorescensmikroskopi.

Abstract

Den genomsnittliga livslängden för en neutrofil är mindre än 24 timmar, vilket begränsar grundforskningen om neutrofiler och tillämpningen av neutrofilstudier. Vår tidigare forskning visade att flera vägar kunde förmedla den spontana döden av neutrofiler. En cocktail utvecklades genom att samtidigt rikta in sig på dessa vägar, caspaser-lysosomalt membranpermeabilisering-oxidant-nekortoshämning plus granulocytkolonistimulerande faktor (CLON-G), vilket förlängde neutrofillivslängden till mer än 5 dagar utan att signifikant äventyra neutrofilfunktionen. Samtidigt utvecklades också ett tillförlitligt och stabilt protokoll för bedömning och utvärdering av neutrofildöd. I detta arbete visar vi att CLON-G kan förlänga neutrofillivslängden in vitro till mer än 5 dagar, och vi uppvisar förlängningen av neutrofillivslängden med FACS och konfokal fluorescensmikroskopi. Denna rapport introducerar procedurer för beredning av CLON-G och visar en in vitro spontan dödsanalys av neutrofiler, som kan användas för studier av neutrofiler och för att därefter undersöka neutrofildöd, vilket ger en tillförlitlig resurs för neutrofilsamhället.

Introduction

Neutrofiler är kända för att omfatta en arsenal av rikliga cytoplasmatiska granuler, nikotinamidadenindinukleotidfosfat (NADPH) oxidas, antimikrobiella enzymer och olika organeller som försvarar mot invaderande mikrober; Dessutom är de mycket rörliga och är de första cellerna som rekryteras till inflammationsstället, vilket innebär att neutrofiler är den första försvarslinjen för det medfödda immunsystemet 1,2. Granulocyttransfusionsterapi har därför blivit en lovande klinisk behandling för neutropenirelaterade infektioner för att tillfälligt öka neutrofilimmuniteten 3,4,5. Nya upptäckter har tydligt visat att neutrofiler också fungerar som flerfasade effektorer i många fysiopatologiska scenarier6. Den genomsnittliga livslängden för en neutrofil är mindre än 24 timmar, och därför är grundforskning om neutrofiler och tillämpningen av neutrofilstudier oerhört svåra på grund av begränsningarna i samband med stabil genetisk manipulation och långvarig lagring 7,8,9,10,11 . Det finns några cellinjer som delvis kan visa upp vissa neutrofila funktioner, såsom HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 och inducerade pluripotenta stamceller12. Dessa cellinjer kan uppnå effektiv genredigering och kryokonservering; De skiljer sig emellertid fortfarande ganska oerhört från primära neutrofiler och kan därför inte troget rekapitulera neutrofila funktioner13. Således är det mesta av forskningen inom detta område fortfarande beroende av nyligen isolerade primära neutrofiler. Fältet bygger fortfarande på att generera dyra och tidskrävande villkorade knock-out-möss för att undersöka specifika genfunktioner i neutrofiler, men inga mänskliga modeller finns för närvarande.

Efter att ha lagt våra ansträngningar på att utforska de heterogena processerna som är involverade i neutrofildöd och de många vägar som reglerar dessa processer14,15, rapporterades nyligen en ny behandling som kallas CLON-G (caspaser-lysosomal membranpermeabilisering-oxidant-nekortoshämning plus granulocytkolonistimulerande faktor) 16. CLON-G består av Q-VD-oph (kinolyl-valyl-O-metylaspartyl-[-2,6-difluorfenoxi]-metylketon), Hsp70 (värmechockprotein 70), DFO (deferoxamin), NAC (N-acetylcystein), Nec-1s (nekrostatin-1s) och G-CSF (granulocytkolonistimulerande faktor). Neutrofil spontan död medieras av flera vägar, inklusive apoptos, nekrotos och pyroptos. Q-VD-oph hämmar apoptos av neutrofiler som en pan-kaspashämmare genom att rikta in sig på kaspas 1, kaspase 3, kaspas 8 och kaspas 917. Neutrofil nekrotos är beroende av en signalväg som involverar receptorinteragerande proteinkinas-1 (RIPK1) och blandat härstamningskinasdomänliknande protein (MLKL)18. Som en RIPK1-hämmare hämmar Nec-1s nekrotos av neutrofiler. Hsp70 och DFO kan hämma lysosomal membranpermeabilisering (LMP), vilket kan inducera neutrofil apoptos19 och pyroptos20. Reaktiva syreradikaler (ROS) spelar viktiga roller i neutrofildöd genom att förmedla LMP19 och apoptos21 och genom att hämma överlevnadssignaler22. Som en antioxidant som kan minska ROS ackumulering, NAC fördröjer neutrofil död. Som tillväxtfaktor aktiverar G-CSF neutrofila överlevnadssignaler och hämmar calpain-inducerad apoptos23,24. Genom att samtidigt rikta in sig på flera neutrofila spontana dödsvägar kan neutrofillivslängden effektivt förlängas till mer än 5 dagar utan att äventyra deras funktion. CLON-G-behandling utökar möjligheterna till neutrofilbevarande, transport och genmanipulation, vilket kan påskynda forskningen i neutrofilsamhället. Under tiden, baserat på kunskapen om neutrofildöd, kan de för närvarande godkända protokollen för celldödsanalyser orsaka oväntad skada på neutrofiler14, så dessa protokoll har förfinats för att vara mer lämpliga för neutrofilstudier. Denna rapport tillhandahåller detaljerade protokoll för neutrofilodling med CLON-G och en in vitro-celldödsanalys av musneutrofiler med flödescytometri och fluorescensavbildning. CLON-G är effektivt på både mus och humana neutrofiler; Musproverna visas dock här för att förenkla detta protokoll. Koncentrationen av NAC är 1 mM för musneutrofiler och 10 μM för humana neutrofiler. Hsp70 är artspecifik och bör därför användas enligt neutrofilens källa. För detta protokoll spelar det ingen roll om neutrofiler isoleras från perifert blod eller benmärg och hur de isoleras.

För den aktuella studien isolerades neutrofiler från musbenmärg för att uppnå tillräckligt med neutrofiler för experimenten, eftersom cirka 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrofiler kan erhållas från benmärgen, medan endast 1 x 10 6 neutrofiler kan isoleras från perifert blod från en enda 8-12 veckor gammal C57BL /6-mus (av båda könen). Gradientcentrifugering utfördes för att undvika eventuella skador och aktivering från mekanisk stimulering av FACS-sortering eller MACS-sortering.

Protocol

Boston Children’s Hospital och State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee godkände och övervakade alla procedurer. Figur 1 visar ett flödesschema över neutrofilodling med CLON-G och in vitro-dödsanalysen . 1. Neutrofil livslängdsförlängning med CLON-G OBS: Alla nämnda operationer och material måste vara sterila. Se till att alla lösningar är väl blandade och…

Representative Results

Wright-Giemsa-färgade morfologin (figur 2A-D) och FACS-fenotyperna (figur 2E-J) hos de CLON-G-behandlade neutrofilerna påverkades inte. Viabiliteten hos CLON-G-behandlade neutrofiler vid 24 timmar var cirka 90%+ baserat på flödescytometrianalys (figur 3) och fluorescerande bildanalyser (figur 4). Lägre livskraft kan bero på felakt…

Discussion

Neutrofiler spelar viktiga roller i medfödd och adaptiv immunitet, och deras homeostas är hårt reglerad. Neutrofiler är de vanligaste leukocyterna i humant perifert blod, och de har en robust och snabb omsättning. En frisk vuxen kan frigöra 1 x 109 neutrofiler/kg dagligen från benmärgen28. Neutrofilers död har därför blivit en av de förbryllande gåtorna på detta område, och mycket ansträngning har ägnats åt att bättre förstå dem. Caspase 29,30,31,32, LMP 33, ROS<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta projekt stöddes av Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Sciences (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Special Research Fund for Central Universities, Peking Union Medical College (3332022062) och Science and Technology Support Program of Sichuan Province (NO. 2021YJ0480).

Materials

0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4612 Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube LABSELECT MCT-001-150 Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-15 Lab consumable.
24 well cell culture plate Falcon 351147 Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-50 Lab consumable.
BD LSRII BD Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich C4901 Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope Perkinelmer UltraVIEW VOX Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate NEST 801001-20mm Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads Thermo Fisher C36950 Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO Sigma Aldrich D9533 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) Sigma Aldrich D2650 Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141C Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V BD 51-65874X Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70 Abcam ab113187 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC Sigma Aldrich A9165 Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s EMD Millipore 852391-15-2 Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) Gibco 15070063 Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI) BioLegend 421301 For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph Selleck chem S7311 Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) Chugai Pharma China GRANOCYTE Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes Falcon 100-0102 Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640 Gibco C11875500BT Component of neutrophil culture basic medium.
Saline LEAGENE R00641 Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH) FENG CHUAN 13-011-00029 pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution Solarbio G1020 Neutrophil cytospin staining.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annual Review of Immunology. 23, 197-223 (2005).
  2. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
  3. Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
  4. Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
  5. Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
  6. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
  7. Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
  8. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  9. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  10. Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
  11. McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
  12. Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
  13. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  14. Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H. Heterogeneity of neutrophil spontaneous death. American Journal of Hematology. 92 (8), E156-E159 (2017).
  15. Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
  16. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  17. Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
  18. Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U. Necroptosis and neutrophil-associated disorders. Cell Death and Disorders. 9 (2), 111 (2018).
  19. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  20. Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
  21. Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
  22. Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
  23. van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
  24. Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
  25. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  26. Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
  27. Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
  28. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  29. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death and Differentiation. 6 (2), 99-104 (1999).
  30. Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
  31. Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
  32. Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
  33. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  34. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  35. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  36. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  37. Zhang, D. -. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
  38. Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -. U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
  39. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  40. George, B., Bhattacharya, S., Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. , (2020).
  41. Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
  42. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  43. Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
  44. Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
  45. Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).

Tags

Neutrophil LifespanCLON-GIn Vitro Spontaneous Death AssayNeutrophil PreservationNeutrophil TransportationNeutrophil Gene ManipulationFlow CytometryFluorescent ImagingCell Culture
check_url/65132?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fan, Y., Teng, Y., Liu, F. t., Ma, F., Hsu, A. Y., Feng, S., Luo, H. R. Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay. J. Vis. Exp. (195), e65132, doi:10.3791/65132 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image