JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Увеличение продолжительности жизни нейтрофилов с помощью CLON-G и анализа спонтанной смерти in vitro

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65132
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People’s Hospital,University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem,Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children’s Hospital,Dana-Farber /Harvard Cancer Center

Summary

Этот протокол подробно описывает подготовку CLON-G для продления продолжительности жизни нейтрофилов до более чем 5 дней и обеспечивает надежную процедуру оценки гибели нейтрофилов с помощью проточной цитометрии и конфокальной флуоресцентной микроскопии.

Abstract

Средняя продолжительность жизни нейтрофила составляет менее 24 ч, что ограничивает фундаментальные исследования нейтрофилов и применение нейтрофильных исследований. Наши предыдущие исследования показали, что несколько путей могут опосредовать спонтанную гибель нейтрофилов. Коктейль был разработан путем одновременного нацеливания на эти пути, каспазы-лизосомальная мембрана, пермеабилизация-оксидант-некроптоз плюс гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (CLON-G), который продлевал продолжительность жизни нейтрофилов до более чем 5 дней без значительного ущерба для функции нейтрофилов. Одновременно был разработан надежный и стабильный протокол оценки и оценки гибели нейтрофилов. В этой работе мы показываем, что CLON-G может продлевать продолжительность жизни нейтрофилов in vitro до более чем 5 дней, и мы демонстрируем удлинение продолжительности жизни нейтрофилов с помощью FACS и конфокальной флуоресцентной микроскопии. В этом отчете представлены процедуры получения CLON-G и продемонстрирован анализ спонтанной смерти нейтрофилов in vitro , который может быть использован для изучения нейтрофилов и для последующего опроса гибели нейтрофилов, тем самым обеспечивая надежный ресурс для сообщества нейтрофилов.

Introduction

Известно, что нейтрофилы включают в себя арсенал обильных цитоплазматических гранул, никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) оксидазы, антимикробных ферментов и различных органелл, которые защищают от вторжения микробов; Кроме того, они очень подвижны и являются первыми клетками, привлеченными к месту воспаления, а это означает, что нейтрофилы являются первой линией защиты врожденной иммунной системы 1,2. Таким образом, гранулоцитарная трансфузионная терапия стала перспективным клиническим методом лечения инфекций, связанных с нейтропенией, для временного повышения иммунитета нейтрофилов 3,4,5. Недавние открытия ясно показали, что нейтрофилы также функционируют как многогранные эффекторы во многих физиопатологических сценариях6. Средняя продолжительность жизни нейтрофила составляет менее 24 часов, и, таким образом, фундаментальные исследования нейтрофилов и применение нейтрофильных исследований чрезвычайно затруднены из-за ограничений, связанных со стабильными генетическими манипуляциями и длительным хранением 7,8,9,10,11 . Есть некоторые клеточные линии, которые могут частично демонстрировать некоторые функции нейтрофилов, такие как HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки12. Эти клеточные линии могут обеспечить эффективное редактирование генов и криоконсервацию; Тем не менее, они по-прежнему сильно отличаются от первичных нейтрофилов и, таким образом, не могут точно повторять функции нейтрофилов13. Таким образом, большая часть исследований в этой области по-прежнему опирается на свежевыделенные первичные нейтрофилы. Эта область по-прежнему полагается на создание дорогостоящих и трудоемких условных нокаутированных мышей для исследования специфических функций генов у нейтрофилов, но в настоящее время не существует человеческих моделей.

Приложив усилия к изучению гетерогенных процессов, связанных с гибелью нейтрофилов, и множественных путей, которые регулируют эти процессы 14,15, недавно сообщалось о новом лечении, получившем название CLON-G (пермеабилизация каспаз-лизосомальной мембраны-ингибирование окислителя-некроптоза плюс гранулоцитарный колониестимулирующий фактор)16. CLON-G состоит из Q-VD-oph (хинолил-валил-O-метиласпартил-[-2,6-дифторфенокси]-метилкетона), Hsp70 (белок теплового шока 70), DFO (дефероксамин), NAC (N-ацетилцистеин), Nec-1s (некростатин-1) и G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). Спонтанная гибель нейтрофилов опосредована несколькими путями, включая апоптоз, некроптоз и пироптоз. Q-VD-oph ингибирует апоптоз нейтрофилов в качестве ингибитора панкаспазы, нацеливаясь на каспазу 1, каспазу 3, каспазу 8 и каспазу 917. Нейтрофильный некроптоз зависит от сигнального пути, включающего взаимодействующую с рецептором протеинкиназу-1 (RIPK1) и доменоподобный белок киназы смешанной линии (MLKL)18. В качестве ингибитора RIPK1 Nec-1s ингибируют некроптоз нейтрофилов. Hsp70 и DFO могут ингибировать пермеабилизацию лизосомальной мембраны (LMP), которая может индуцировать апоптознейтрофилов 19 и пироптоз20. Активные формы кислорода (АФК) играют жизненно важную роль в гибели нейтрофилов, опосредуя LMP19 и апоптоз21 и ингибируя сигналывыживания 22. Как антиоксидант, который может уменьшить накопление АФК, NAC задерживает гибель нейтрофилов. В качестве фактора роста G-CSF активирует сигналы выживания нейтрофилов и ингибирует индуцированный кальпаином апоптоз23,24. Одновременно нацеливаясь на несколько путей спонтанной гибели нейтрофилов, продолжительность жизни нейтрофилов может быть эффективно увеличена до более чем 5 дней без ущерба для их функции. Лечение CLON-G расширяет возможности сохранения, транспортировки и манипулирования генами нейтрофилов, что может ускорить исследования в сообществе нейтрофилов. Между тем, основываясь на знаниях о гибели нейтрофилов, утвержденные в настоящее время протоколы анализов клеточной смерти могут вызвать неожиданное повреждение нейтрофилов14, поэтому эти протоколы были усовершенствованы, чтобы быть более подходящими для исследований нейтрофилов. В этом отчете представлены подробные протоколы культивирования нейтрофилов с помощью CLON-G и анализа in vitro на гибель клеток нейтрофилов мыши с использованием проточной цитометрии и флуоресцентной визуализации. CLON-G эффективен как на мышиных, так и на человеческих нейтрофилах; Тем не менее, образцы мышей демонстрируются здесь, чтобы упростить этот протокол. Концентрация NAC составляет 1 мМ для нейтрофилов мыши и 10 мкМ для нейтрофилов человека. Hsp70 является видоспецифичным и, таким образом, должен использоваться в соответствии с источником нейтрофила. Для этого протокола не имеет значения, выделены ли нейтрофилы из периферической крови или костного мозга и как они выделены.

Для настоящего исследования нейтрофилы были выделены из костного мозга мыши, чтобы получить достаточное количество нейтрофилов для экспериментов, так как из костного мозга можно получить около 1 x 10 7-1,5 x 107 нейтрофилов, в то время как только 1 x 10 6 нейтрофилов может быть выделен из периферической крови одной 8-12-недельной мыши C57BL /6 (любого пола). Градиентное центрифугирование проводили, чтобы избежать возможных повреждений и активации от механического воздействия сортировки FACS или сортировки MACS.

Protocol

Бостонская детская больница и Государственная ключевая лаборатория экспериментальной гематологии (SKLEH) Комитет по уходу за животными и их использованию одобрили и контролировали все процедуры. На рисунке 1 показана блок-схема культивирования нейтрофилов с помощью CLON-G…

Representative Results

Морфология нейтрофилов, окрашенных по Райту-Гимзе (рис. 2A-D) и фенотипы FACS (рис. 2E-J) нейтрофилов, обработанных CLON-G, не были затронуты. Жизнеспособность нейтрофилов, обработанных CLON-G, через 24 часа составила около 90%+ на осн…

Discussion

Нейтрофилы играют жизненно важную роль во врожденном и адаптивном иммунитете, и их гомеостаз жестко регулируется. Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитами в периферической крови человека, и они имеют прочный и быстрый оборот. Здоровый взрослый человек может выделя?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект был поддержан Инновационным фондом Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Инновационным фондом медицинских наук Китайской академии медицинских наук (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Специальным исследовательским фондом центральных университетов, Пекинским союзным медицинским колледжем (3332022062) и Программой поддержки науки и технологий провинции Сычуань (NO. 2021YJ0480).

Materials

0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4612 Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube LABSELECT MCT-001-150 Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-15 Lab consumable.
24 well cell culture plate Falcon 351147 Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-50 Lab consumable.
BD LSRII BD Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich C4901 Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope Perkinelmer UltraVIEW VOX Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate NEST 801001-20mm Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads Thermo Fisher C36950 Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO Sigma Aldrich D9533 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) Sigma Aldrich D2650 Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141C Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V BD 51-65874X Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70 Abcam ab113187 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC Sigma Aldrich A9165 Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s EMD Millipore 852391-15-2 Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) Gibco 15070063 Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI) BioLegend 421301 For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph Selleck chem S7311 Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) Chugai Pharma China GRANOCYTE Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes Falcon 100-0102 Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640 Gibco C11875500BT Component of neutrophil culture basic medium.
Saline LEAGENE R00641 Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH) FENG CHUAN 13-011-00029 pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution Solarbio G1020 Neutrophil cytospin staining.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annual Review of Immunology. 23, 197-223 (2005).
  2. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
  3. Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
  4. Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
  5. Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
  6. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
  7. Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
  8. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  9. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  10. Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
  11. McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
  12. Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
  13. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  14. Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H. Heterogeneity of neutrophil spontaneous death. American Journal of Hematology. 92 (8), E156-E159 (2017).
  15. Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
  16. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  17. Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
  18. Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U. Necroptosis and neutrophil-associated disorders. Cell Death and Disorders. 9 (2), 111 (2018).
  19. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  20. Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
  21. Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
  22. Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
  23. van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
  24. Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
  25. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  26. Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
  27. Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
  28. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  29. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death and Differentiation. 6 (2), 99-104 (1999).
  30. Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
  31. Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
  32. Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
  33. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  34. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  35. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  36. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  37. Zhang, D. -. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
  38. Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -. U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
  39. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  40. George, B., Bhattacharya, S., Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. , (2020).
  41. Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
  42. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  43. Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
  44. Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
  45. Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).

Tags

Neutrophil LifespanCLON-GIn Vitro Spontaneous Death AssayNeutrophil PreservationNeutrophil TransportationNeutrophil Gene ManipulationFlow CytometryFluorescent ImagingCell Culture
check_url/65132?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fan, Y., Teng, Y., Liu, F. t., Ma, F., Hsu, A. Y., Feng, S., Luo, H. R. Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay. J. Vis. Exp. (195), e65132, doi:10.3791/65132 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image