Denne protokollen beskriver fremstillingen av CLON-G for å forlenge den nøytrofile levetiden til mer enn 5 dager og gir en pålitelig prosedyre for evaluering av nøytrofil død med flowcytometri og konfokal fluorescensmikroskopi.
Den gjennomsnittlige levetiden til en nøytrofil er mindre enn 24 timer, noe som begrenser grunnleggende forskning på nøytrofiler og anvendelse av nøytrofile studier. Vår tidligere forskning indikerte at flere veier kunne formidle spontan død av nøytrofiler. En cocktail ble utviklet ved samtidig å målrette disse veiene, kaspaser-lysosomale membranpermeabilisering-oksidant-nekroptoseinhibering pluss granulocytkolonistimulerende faktor (CLON-G), som forlenget den nøytrofile levetiden til mer enn 5 dager uten signifikant å kompromittere den nøytrofile funksjonen. Samtidig ble det også utviklet en pålitelig og stabil protokoll for vurdering og evaluering av nøytrofil død. I dette arbeidet viser vi at CLON-G kan forlenge den nøytrofile levetiden in vitro til mer enn 5 dager, og vi viser forlengelsen av den nøytrofile levetiden med FACS og konfokal fluorescensmikroskopi. Denne rapporten introduserer prosedyrer for fremstilling av CLON-G og viser en in vitro spontan dødsanalyse av nøytrofiler, som kan brukes til studier av nøytrofiler og for senere å undersøke nøytrofil død, og dermed gi en pålitelig ressurs for det nøytrofile samfunnet.
Nøytrofiler er kjent for å omfatte et arsenal av rikelig cytoplasmatiske granulater, nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADPH) oksidase, antimikrobielle enzymer og forskjellige organeller som forsvarer seg mot invaderende mikrober; I tillegg er de svært bevegelige og er de første cellene som rekrutteres til betennelsesstedet, noe som betyr at nøytrofiler er den første forsvarslinjen til det medfødte immunsystemet 1,2. Granulocyttransfusjonsbehandling har dermed blitt en lovende klinisk behandling for nøytropenirelaterte infeksjoner for forbigående å øke nøytrofil immunitet 3,4,5. Nylige funn har tydelig vist at nøytrofiler også fungerer som mangefasetterte effektorer i mange fysiopatologiske scenarier6. Den gjennomsnittlige levetiden til en nøytrofil er mindre enn 24 timer, og dermed er grunnleggende forskning på nøytrofiler og anvendelse av nøytrofile studier enormt vanskelig på grunn av begrensningene knyttet til stabil genetisk manipulasjon og langsiktig lagring 7,8,9,10,11 . Det er noen cellelinjer som delvis kan vise frem noen nøytrofile funksjoner, som HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 og induserte pluripotente stamceller12. Disse cellelinjene kan oppnå effektiv genredigering og kryopreservering; Imidlertid er de fortsatt ganske forskjellige ganske enormt fra primære nøytrofiler og kan derfor ikke trofast rekapitulere nøytrofile funksjoner13. Dermed er det meste av forskningen på dette feltet fortsatt avhengig av ferskt isolerte primære nøytrofiler. Feltet er fortsatt avhengig av å generere dyre og tidkrevende betingede knock-out mus for å undersøke spesifikke genfunksjoner i nøytrofiler, men ingen menneskelige modeller eksisterer for øyeblikket.
Etter å ha lagt vår innsats i å utforske de heterogene prosessene som er involvert i nøytrofil død og de mange veiene som regulerer disse prosessene14,15, ble det nylig rapportert en ny behandling kalt CLON-G (caspases-lysosomal membranpermeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor) 16. CLON-G består av Q-VD-oph (kinolyl-valyl-O-metylaspartyl-[-2,6-difluorfenoksy]-metylketon), Hsp70 (varmesjokkprotein 70), DFO (deferoksamin), NAC (N-acetylcystein), Nec-1s (nekrostatin-1s) og G-CSF (granulocyttkolonistimulerende faktor). Nøytrofil spontan død er mediert av flere veier, inkludert apoptose, nekroptose og pyroptose. Q-VD-oph hemmer apoptosen av nøytrofiler som en pan-caspase-hemmer ved å målrette caspase 1, caspase 3, caspase 8 og caspase 917. Nøytrofil nekroptose er avhengig av en signalvei som involverer reseptorinteragerende proteinkinase-1 (RIPK1) og blandet avstamning kinase domenelignende protein (MLKL)18. Som en RIPK1-hemmer Nec-1s nekriptosen av nøytrofiler. Hsp70 og DFO kan hemme lysosomal membranpermeabilisering (LMP), som kan indusere nøytrofil apoptose19 og pyroptose20. Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i nøytrofil død ved å formidle LMP19 og apoptose21 og ved å hemme overlevelsessignaler22. Som en antioksidant som kan redusere ROS-akkumulering, forsinker NAC nøytrofil død. Som vekstfaktor aktiverer G-CSF nøytrofile overlevelsessignaler og hemmer kalpainindusert apoptose23,24. Ved samtidig å målrette mot flere nøytrofile spontane dødsveier, kan den nøytrofile levetiden effektivt forlenges til mer enn 5 dager uten at det går ut over funksjonen. CLON-G-behandling utvider mulighetene for nøytrofil bevaring, transport og genmanipulasjon, noe som kan akselerere forskning i nøytrofilsamfunnet. I mellomtiden, basert på kunnskapen om nøytrofil død, kan de for tiden godkjente protokollene for celledødsanalyser forårsake uventet skade på nøytrofiler14, så disse protokollene har blitt raffinert for å være mer hensiktsmessige for nøytrofile studier. Denne rapporten gir detaljerte protokoller for nøytrofildyrking med CLON-G og en in vitro celledødsanalyse av nøytrofile museer ved bruk av flowcytometri og fluorescensavbildning. CLON-G er effektiv på både mus og humane nøytrofiler; Imidlertid er museprøvene demonstrert her for å forenkle denne protokollen. Konsentrasjonen av NAC er 1 mM for nøytrofiler fra mus og 10 μM for humane nøytrofiler. Hsp70 er artsspesifikk og bør derfor utnyttes i henhold til kilden til nøytrofilen. For denne protokollen spiller det ingen rolle om nøytrofiler er isolert fra perifert blod eller benmarg og hvordan de er isolert.
For denne studien ble nøytrofiler isolert fra musebenmarg for å oppnå nok nøytrofiler til forsøkene, da ca. 1 x 10 7-1,5 x 107 nøytrofiler kan fås fra benmargen, mens bare 1 x 10 6 nøytrofiler kan isoleres fra perifert blod av en enkelt 8-12 uker gammel C57BL /6 mus (av begge kjønn). Gradient sentrifugering ble utført for å unngå mulig skade og aktivering fra mekanisk stimulering av FACS sortering eller MACS sortering.
Neutrofiler spiller viktige roller i medfødt og adaptiv immunitet, og deres homeostase er tett regulert. Neutrofiler er de mest tallrike leukocytter i humant perifert blod, og de har en robust og rask omsetning. En frisk voksen kan frigjøre 1 x 109 nøytrofiler/kg daglig fra benmargen28. Døden av nøytrofiler har dermed blitt en av de forvirrende gåtene i dette feltet, og mye innsats har blitt viet til å bedre forstå dem. Kaspase 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33<…
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble støttet av Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Sciences (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Special Research Fund for Central Universities, Peking Union Medical College (3332022062), og Science and Technology Support Program of Sichuan Province (NO. 2021YJ0480).
0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |